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CD8 T细胞对胃腺癌细胞雌激素受体表达影响 　　【摘要】 目的 观察CD8+ T细胞对胃癌细胞增殖及其表面受体雌激素受体α（ERα）的影响。方法 应用健康成人外周血分离得到的CD8+ T细胞与胃腺癌细胞系SGC-7901混合培养。混合培养96 h后用经流式细胞仪检查细胞周期；免疫荧光法检测分析共培养48 h后SGC-7901细胞的凋亡情况及雌激素受体表达情况。结果 经流式细胞仪检查， 混合培养96 h后CD8+ T细胞与SGC-7901细胞粘附， 大部分SGC-7901细胞滞留在G1期；混合培养组与对照组相比， SGC-7901细胞膜上表达ERα数明显降低。结论 CD8+ T细胞抑制胃癌细胞增殖的同时降低ERα的表达， 为深入研究胃癌的生物治疗及靶向治疗奠定了基础。 　　【关键词】 CD8+ T细胞；胃癌；SGC-7901细胞；雌激素受体 　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.019 　　胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一， 全球超过 40%的胃癌病例发生在中国， 死亡率在恶性肿瘤中占第二位[1]。目前对胃癌的治疗主要是采用以手术为主的综合治疗， 但总体效果不令人满意。由于肿瘤患者机体免疫功能低下或缺陷与恶性肿瘤发生发展的各阶段关系密切， 而病情发展又进一步加重免疫低下状态， 恶性肿瘤的免疫治疗已成为目前的研究热点。 　　CD8+ T 细胞又称作 T 抑制细胞或细胞毒 T 细胞， 可以特异性识别细胞表面的MHCI 类抗原从而特异性杀死肿瘤细胞， 在抗肿瘤免疫中起到了重要作用。但其作用的相关机制还不清楚。在本研究中， 应用健康成人外周血分离得到的CD8+ T细胞与胃腺癌细胞系SGC-7901共培养， 通过免疫荧光法检测分析共培养48 h后SGC-7901细胞的凋亡情况及雌激素受体表达水平， 以期为临床筛选个体化治疗方案提供理论依据， 前瞻性指导肿瘤患者的免疫治疗， 具体报告如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 外周血单个核细胞分离 将10 ml全血（健康志愿者）转入50 ml离心管中， 加入10 ml PBS溶液稀释， 轻轻混匀；取两支15 ml离心管， 先加入5 ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的Ficoll上层， 每只离心管各10 ml稀释血液；2000 r/min， 30 min；用1 ml枪头插到白色云五层， 吸取单个核细胞（PBMC）置另一干净的15 ml离心管中。加入PBS至10～15 ml， 1500 r/min， 10 min离心后去掉上清， 再加入培养基（RPMI 1640+10% FBS）进行相同操作的清洗2次。 　　1. 2 外周血单个核细胞培养 分离得到的PBMC用RPMI 1640+10% FBS+异戊烯焦磷酸（IPP） 1 μg/ml+白细胞介素-2 （IL-2） 20万U/ml培养， 2～3 d换培养基一次， 第五代（P5）用于实验。 　　1. 3 流式细胞仪检查T细胞表型 取100 μl细胞与PBS+2%胎牛血清（FBS）混悬液， 分别加入10 μl CD3、CD4、CD8抗体（贝克曼公司）， 震荡器充分混匀后， 室温避光放置10 min；裂解红细胞：混合液放置10 min后， 加入红细胞裂解液500 μl （贝克曼公司）， 均匀混合后， 室温避光放置10 min；离心（2000 r/min， 5 min）后倒掉上清， 上机检测：加入500 μl的缓冲液， 混匀后上流式细胞仪器检测（仪器为贝克曼公司FC500型流式细胞仪）。 　　1. 4 CD8+ T分离 取5个小平皿（60 mm）， 加入10%多聚赖氨酸0.5 ml， 37℃5%CO2培养箱中过夜。4℃加入CD8抗体2 μl 4 h。加入上述单个核细胞混悬液过夜。次晨， 去上清。0.25%胰酶消化贴壁的细胞。细胞计数板计数后， 取10000个细胞进行流式细胞仪检测， 方法同上。 　　1. 5 CD8+ T与SGC-7901细胞共培养 SGC-7901细胞计数后， 平均铺到5个小平皿（60 mm）中， 过夜培养让细胞贴壁， 融合率到70%～80%。取两小平皿用胰酶消化， 计数后分别按CD8+ T与SGC-7901细胞1∶10加入成为贴壁肿瘤细胞+T细胞培养组；单独SGC-7901细胞和单独T细胞为对照组。SGC-7901细胞与CD8+ T细胞共培养48 h后显微镜观察细胞增殖情况；吸去旧培养基按相同比例换含新CD8+ T细胞的新鲜培养基继续培养48 h。培养96 h后， 吸去培养基， 进行细胞周期检测和免疫荧光检查。 　　1. 6 细胞周期检测 CD8+ T与SGC-7901细胞混合培养在96 h后， 0.25%胰酶消化。消化后的细胞经PBS 清洗2