OX40OX40L共刺激信号在血管平滑肌细胞增殖中作用.docVIP

OX40OX40L共刺激信号在血管平滑肌细胞增殖中作用 　　摘要：目的 观察OX40/OX40L对血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。方法 原代培养人脐静脉血管平滑肌细胞，设计OX40L小分子干扰片段，转染VSMCs。实验分3组：OX40LRNA干扰组（SiOX40L）、NC组和空白对照组（ Con）。将SiOX40L和NC用脂质体2000转染入VSMCs，提取细胞的总RNA，逆转录成cDNA，用real-timePCR的方法检测VSMCs中OX40L和OX40的mRNA表达，用免疫组织化学方法检测VSMCs中的OX40L的蛋白表达，并用MTT法检测OX40L对VSMCs增殖的影响。结果 SiOX40L组OX40L和OX40的mRNA表达显著减少，且该组血管平滑肌细胞增殖明显增强。结论 OX40/OX40L系统可能参与了VSMCs的增殖。 　　关键词：OX40L；OX40；血管平滑肌细胞；增殖 　　中图分类号：R363.2 文献标识码：A 　　血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）是大血管中膜的重要组成，VSMCs增殖使血管厚度增加，当其移行至内膜下就成为动脉斑块的主要成分之一，在动脉粥样硬化早期减少血管平滑肌细胞增殖能够延缓动脉粥样硬化的进程[1]。共刺激分子OX40L（CD134L）和OX40（CD134） 都属于肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily number 4）成员，参与了免疫、炎症等过程，是AS的相关基因[2]。但OX40L/OX40共刺激信号是否参与了VSMCs增殖，目前尚不清楚。本研究通过培养原代血管平滑肌细胞，用OX40L小分子干扰片段转染VSMCs，观察OX40L/OX40共刺激信号对血管平滑肌细胞增殖的影响，为早期延缓动脉粥样进程提供理论基础。 　　1资料与方法 　　1.1细胞及试剂 SiOX40L由天根生物公司合成，RNA提取试剂盒购自Omega公司，MTT、胰蛋白酶和逆转录酶购自Sigma公司，LipoFectamine2000购自罗氏公司，OX40L单克隆抗体购自博奥森生物技术公司，胎牛血清购自Gibco公司，其余试剂为国产分析纯。 　　1.2原代血管平滑肌细胞培养 取剖宫产术后的正常胎儿脐静脉（来自宁夏国龙医院妇产科），用D-Hanks液反复冲洗后剥离血管外膜及结缔组织，纵向剪开血管，刮刀轻轻拭去内膜后将血管条剪成1mm×1mm的小块，以3～5块/cm2密度均匀贴于培养?J底，置37℃、5%CO2孵箱培养，用差速贴壁法去除其它杂细胞。约7～10d后，细胞从组织块边缘长出，待细胞达70%融合后，相差显微镜观察细胞的形态和生长状况，并用α-actin免疫组织化学进行鉴定，经鉴定阳性后进行后续实验，实验用3～6 代细胞。 　　1.3 SiOX40L片段转染入血管平滑肌细胞 血管平滑肌细胞用0.125%胰酶消化约2min，离心后按1×104个/cm3密度接种到6孔板继续培养24h，当细胞生长至60%～70% 融合后换用无血清培养液，按照LipoFectamine2000脂质体转染试剂盒说明书进行转染，分为空白对照组、SiOX40L组和NC组，无血清培养基培养6h后，终止转染，继续培养24h，收集细胞并提取细胞的RNA和蛋白，分别用real-time PCR检测各组细胞OX40L和OX40的mRNA表达，用免疫组织化学染色检测各组细胞OX40L的蛋白表达。 　　1.4 SiOX40L对血管平滑肌细胞增殖的影响 取对数生长期生长状态良好的细胞，按1×104细胞/孔接种至96孔板中，用含10%FBS的DMEM 培养基培养约12 h。按1.3的方法将SiOX40L转染入血管平滑肌细胞，48 h 后每孔均加入10μl MTT（5g/L），4 h后弃上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡3min，于570 nm 检测吸光值。 　　2结果 　　2.1血管平滑肌细胞的培养与鉴定 相差显微镜下观察，血管平滑肌细胞在原代培养时第7～9d后可见细胞从贴块边缘爬出，呈长梭形，2～3w后，细胞沿植块周围呈放射状生长。传代培养的细胞6h后可贴壁，细胞为长梭形，高低起伏，呈现VSMCs特征性的峰、谷状生长，α-actin免疫组织化学染色阳性，见图1。 　　2.2 OX40L在VSMCs中的表达 转染VSMCs 48h 后，分别提取各组染细胞的总RNA和蛋白，用实时荧光定量PCR和免疫组织化学的方法观察OX40L的mRNA和蛋白表达。结果显示，空白对照组和NC组OX40L的mRNA和蛋白表达没有统计学差异。SiOX40L转染VSMCs后，细胞OX40L的mRNA表达较空白对照组和NC组分别降低了67%和