EBER显色原位杂交技术在口腔颌面部淋巴上皮癌中应用体会.docVIP

EBER显色原位杂交技术在口腔颌面部淋巴上皮癌中应用体会 　　[摘要] 目的 探讨EBER显色原位杂交技术（CISH）在口腔颌面部淋巴上皮癌中特有的操作与改进方法。 方法 应用CISH技术，荧光素标记的寡核苷酸探针EBER原位杂交检测试剂盒对40例疑为口腔颌面部淋巴上皮癌的病例进行EBER检测。 结果 EBER阳性率为95%；阳性信号主要定位在肿瘤上皮细胞巢的细胞核上，呈棕黄色，周围淋巴细胞及正常组织未见明显着色；信号定位准确，染色结果清晰易辨，无背景干扰。 结论 简化操作EBER原位杂交检测试剂盒能够节省时间、增强信号强度和提高工作效率等。 　　[关键词] EBER；显色原位杂交技术 ；淋巴上皮癌；EB病毒 　　[中图分类号] R739.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（b）-0055-03 　　EBER（Epstein-Barr virus-encoded RNA）为EB病毒的表达产物，是EB病毒编码的mRNA，在细胞核中以高拷贝数存在[1]。人感染EB病毒与鼻咽癌的发生有密切关系[2-4]，在全身其他肿瘤性疾病（传染性单核细胞增多症、多发性硬化症、伯基特淋巴瘤等）中也有一定比例的EB病毒感染[5]。部分发生于口腔颌面部的肿瘤如淋巴上皮癌、结外NK/T细胞淋巴瘤中[6-7]，EBER的表达情况可以作为辅助诊断的手段，为肿瘤诊断提供必要依据。EBER显色原位杂交技术（chromogenic in situ hybridization，CISH）是检测EBER是否表达的技术之一，其原理是利用EBER特异性探针与标本中EBER靶序列互补、杂交后，通过DAB显色技术，确定标本中是否存在EB病毒感染，该方法具有极高特异性和灵敏性，可用于石蜡和冷冻切片的检测。目前，CISH已应用于鼻咽癌等肿瘤的辅助诊断，近两年来，本科室对疑为淋巴上皮癌的病例进行EB病毒感染的检测，现把操作体会总结如下。 　　1.1 材料与方法 　　1.1 标本收集 　　收集2012年9月～2013年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科疑为淋巴上皮癌的石蜡标本共40例，其中男性21例，女性19例，年龄23～85岁，中位年龄51.5岁。发病部位：腮腺18例，腭部8例，颌下7例，舌根3例，颈部和颊各2例。10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片厚3 μm。 　　1.2 杂交试剂与设备 　　杂交所用试剂盒为荧光素标记的寡核苷酸探针EBER原位杂交检测试剂盒（Bio Genex）；玻片为APES胶处理片；杂交仪为DAKO的Hybridizer；电热恒温水浴箱为上海精宏实验设备有限公司的DK-8P；培养箱为Thermoscientific公司的HERATHERM incubator。 　　1.3 杂交方法 　　具体操作方法按照以下步骤：①石蜡切片经65℃干燥箱烘烤3 h以上，二甲苯及梯度乙醇水化；②蛋白酶K处理12 min，PBS浸洗3次；③滴加EBER探针10 μl；④杂交仪37℃孵育16 h，48℃ PBS浸洗3次；⑤滴加一抗，37℃孵育1 h；⑥滴加信号放大剂Super Enhancer 20 min；⑦滴加HRP标记聚合物30 min，DAB显色，复染1 min；⑧脱水透明，中性树胶封片，镜下观察结果。阴性对照为由不含检测目的碱基的杂交液代替EBER探针，其他步骤同上。 　　2 结果 　　40例疑为淋巴上皮癌的被检样本中，38例检测出阳性，阳性率为95%；阳性信号主要定位在肿瘤上皮细胞巢的细胞核上，呈棕黄色，周围淋巴细胞及正常组织未见明显着色；阳性信号定位准确，染色结果清晰易辨，无背景干扰（图1）。阴性对照中未见明显着色（图2）。 　　图1 淋巴上皮癌EBER显色原位杂交阳性结果 　　EBER检测显示阳性信号定位准确，染色结果清晰易辨，无背景干扰 （CISH×100） 　　图2 淋巴上皮癌+阴性对照探针染色结果 　　EBER检测显示阴性对照片中无明显阳性表达（CISH×100） 　　3讨论 　　对疑有EB病毒感染的病例，免疫组化检测低拷贝数RNA 时检出率较低，而CISH检出率高，定位清晰，是检测EB病毒感染的金标准[1，8]。 　　与免疫组织化学检测方法一样，为保证检测结果的可靠性，应同时设阴性、阳性对照片[9-11]，本研究中在每批样本检测时均同时做阴性和阳性对照，结果表明阳性对照中均有EBER的阳性表达，而阴性对照片中均为阴性，提示本研究结果较为可靠。 　　与DNA探针相比，在EBER杂交过程中省去了变性环节，因而避免了因变性不彻底而致的假阴性，但除组织需得到恰当的固定之外[11-13]，本研究发现酶消化时间、杂交温度及时间和洗涤温度及时间等对于CISH的成功染色较