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Fas在DCDs模型鼠神经元凋亡中作用初探 　　【摘要】 目的 探讨皮质发育障碍（Disorderofcortical developments，DCDs）模型鼠海马神经元凋亡可能的细胞转导机制。方法 利用卡莫司汀（BCNU）诱导建立SD大鼠皮质发育障碍动物模型，在出生后0天（A0）、15天（A15）、30天（A30）、45天（A45）和60天（A60）时，采用TUNEL检测海马区神经元凋亡指数，免疫组化法对模型鼠和正常鼠检测海马区Fas分子的表达，并结合图像分析系统进行结果分析。结果 针对SD大鼠皮质发育障碍的动物模型已成功建立；将其与对照组进行比较，TUNEL结果：A0模型鼠组，海马区神经元凋亡无明显变化；而A15、A30、A45、A60模型组，其神经元凋亡有统计学差异（P0.05），显逐步加重趋势。免疫组化检测结果显示：随存活时间延长，模型组海马神经元Fas表达逐渐增强，其值较对照组增高，具有显著统计学意义（P0.05）。结论 皮质发育障碍模型鼠海马区存在显著的神经元凋亡，Fas可能参与了其凋亡过程中的信号传导。 　　【关键词】 皮质发育障碍；细胞凋亡；Fas （APO-1或CD95） 　　所谓皮质发育障碍（缩写DCDs）是难治性癫痫发病的主要原因，但诱发机制仍不能确定。多数学者认为神经网络、环路重组是发病原因之一，而神经元凋亡则可能在神经网络、环路重组中起决定性作用[1]。 　　本实验拟采用卡莫司汀模型，诱导建立SD大鼠皮质发育障碍模型，并通过TUNEL检测海马区神经元细胞的凋亡情况，免疫组化检测神经元细胞Fas分子的表达，分析皮质发育障碍鼠海马神经元凋亡的可能信号传导机制，为探讨难治性癫痫的发病机制提供思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 模型制作 孕17天的l0只体重约在300g左右的SD大鼠（由川北医学院中心提供）。皮质发育障碍模型组为随机抽取的5只SD大鼠，在孕17天向SD孕鼠腹腔注射卡莫司汀（15mg/kg，将其用生理盐水稀释至4mg/m1）；给对照组（另外5只SD大鼠）腹腔注射生理盐水，处理后将所有SD大鼠正常喂养。模型组孕鼠共产仔52只、存活46只；对照组孕鼠产仔58只，存活55只。从模型组和正常组各随机抽取40只仔鼠，每个时间点8只，标记为A0、A15、A30、A45、A60[2]。 　　1.2 子代大鼠的观察 在各时间点测量各组仔鼠体重，观察仔鼠的一般行为是否正常、是否有癫痫病发作等。 　　1.3 制作标本 分别在A0、A15、A30、A45和A60各时间点，从对照组和模型组各随机抽取4只子鼠，从腹腔为其注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）将其麻醉。再由主动脉灌注4%多聚甲醛-PB液500ml（0.1mol/L，PH7.4）行内固定，选海马最大切面处制作标本，经过整夜的水洗后，再进行脱水、透明、石蜡包埋处理，制成4mm厚的石蜡切片。 　　1.4 对海马神经元凋亡的TUNEL检测 制备好标本后，每个标本取邻近的2张切片行TUNEL染色。参照Roche公司试剂盒说明书上注明的方法进行操作。在显微镜下观察细胞核，核内出现可见的棕黄色凋亡小体就是阳性细胞，选取海马神经细胞分布均匀的视野，在40倍物镜下计数l0个视野，统计凋亡细胞数，将其作为海马神经细胞凋亡指标。 　　1.5 免疫组化ABC法检测Fas表达 标本制作同上，按常规操作，工作浓度：Fas为1：150。试剂一抗（兔抗鼠单克隆Fas抗体及检测试剂，按（武汉博士德公司试剂）说明书操作。将免疫组化染色的切片放在Nikon-80i显微图像分析系统中，进行分析，阳性细胞其胞质染色呈棕黄色。 　　1.6 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行统计处理。对TUNEL阳性细胞、Fas阳性细胞通过计算机显微图像分析系统进行观察，用 χ±s表示各组测定数据（即阳性细胞个数），利用方差进行分析（P0.05），结果为显著性差异。 　　2 观察结果 　　2.1 对子鼠一般行为的观察 经观察，5只模型组子鼠体形偏小，并伴有轻度嗜睡，活动量及灵活性均有所降低等。试验过程中自发性癫痫未发作。 　　2.2 海马神经元凋亡 通过光镜观察，TUNEL染色阳性凋亡神经元的细胞核呈棕黄色，核固缩深染，核内染色质浓聚，染色质在核周围较为浓集，呈长条形、新月形、块状小体、环形甚至形成核碎片，而其神经元体积缩小，呈扇形或三角形。而阴性神经元形态正常，细胞核不显示黄色，容易区分。染色结果表明，在对照组子鼠A0和A15海马未见TUNEL阳性细胞，A30、A45和A60有少量TUNEL标记细胞。模型组子鼠虽然在A0时海马未见TUNEL阳性细胞，但在随后的各时点可见TUNEL阳性细胞，且随鼠龄的增长呈增长趋势。两组相比，除A0外其余各时点，模型组子鼠海马TUNEL阳性细胞