microRNA―130a抑制KGN细胞FOXL2基因表达及对细胞增殖影响.docVIP

microRNA―130a抑制KGN细胞FOXL2基因表达及对细胞增殖影响 　　[摘要]目的：研究外源性microRNA-130a在卵巢颗粒细胞KGN中过表达对FOXL2基因表达的影响，探索microRNA-130a对KGN细胞增殖的影响。方法：人工设计合成靶向FOXL2基因的microRNA-130a模拟物，脂质体法将microRNA-130a模拟物转染入KGN细胞中，Trizol法和RIPA蛋白裂解法分别获取高纯度的细胞总RNA和总蛋白，实时荧光定量聚合酶联反应（FQ-PCR）检测microRNA模拟物转染后细胞中FOXL2基因mRNA表达水平，Western Blot检测FOXL2蛋白表达水平，四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测microRNA-130a转染后KGN细胞的增殖情况。 结果：成功转染KGN细胞后，阴性对照组FOXL2基因mRNA和蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显的差异（P0.05），miR-130a转染组能显著抑制FOXL2 mRNA和蛋白的表达，与空白对照组和阴性对照组相比均有统计学差异（p0.05）。MTT法检测各组KGN细胞的OD值及细胞增值率，microRNA-10a转染后能明显促进KGN细胞的增殖，与与空白对照组和阴性对照组相比均有统计学差异（P0.05）。结论：外源性的miR-130a对FOXL2基因mRNA和蛋白表达有明显的抑制作用，且能明显促进KGN细胞的增殖。 　　[关键词] miR-130a；转染；KGN细胞：FOXL2；基因表达调控；细胞增殖 　　[中图分类号]Q813.1 　　[文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）01-0030-04 　　FOXL2是叉头框转录因子家族成员之一，主要表达在眼周、卵巢和垂体细胞中，该基因最早由Crisponi作为小睑裂综合征（BPES，Blepharophimosis Syndrome，MIM： 110100）及卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）的候选基因被克隆定位Ⅲ。小睑裂综合征是一种常染色体显性遗传病，临床上以睑裂狭小，上睑下垂，反向性内眦赘皮和内眦远距为主要征象，BPES根据是否存在卵巢早衰分为两型，I型合并有卵巢早衰（premature ovarianfailure，POF），II型只表现为眼睑畸形，超过2/3的BPES患者携带有FOXL2的基因内突变，此外FOXL2的杂合突变还能导致卵巢功能早衰和女性不孕。FOXL2作为转录因子功能的发挥需要FOXL2基因本身的磷酸化激活，发生FOXL2基因突变的体细胞FOXL2功能失活，研究证实FOXL2基因突变能够促进细胞的增殖，以及抑制细胞的凋亡。 　　microRNA是生物体内源长度约为21-25个核苷酸的非编码小分子RNA[7]，microRNA通过与靶mRNA的3’端非编码区域（3’-untranslatedregion，3’UTR）互补配对导致mRNA的翻译抑制或降解，从而在转录水平上对基因的表达进行负调控。microRNA对维持生物体正常的生理功能具有重要的意义，microRNA在体内的异常表达与人类许多疾病有关，包括一些精神疾以及肿瘤的发生、发展等，生物信息学研究表明生物体内超过60%的蛋白编码基因受体内靶向microRNA的调控。 　　鉴于microRNA对基因的调控功能以及FOXL2是小睑裂综合症的致病基因，本研究利用生物信息学研究工具筛查出在小睑裂综合症中异常表达的microRNA，人工设计合成miR-130a mimics，将miR-130a mimics瞬时转染入卵巢颗粒细胞KGN中，研究miR-130a mimics对FOXL2基因表达的调控作用，以及对KGN细胞增殖的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与试剂 　　KGN细胞株由潍坊医学院整形外科实验室保存，DMEM培养液、OptiMEM ReducedSerum Medium、Lipofectamine3000 Reagent、新生牛血清、MTT细胞增殖试剂均购自美国GIBCO（Invrotrigen）公司。microRNAmlmics由英潍捷基（上海）贸易有限公司提供，逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNAeraser（Perfect Real Time）和荧光定量PCR试剂MightyAmpfor Real Time（SYBR Plus）（2×）均购自日本的Takara公司，Western Blot抗FOXL2基因的一抗、二抗均购自上海优宁维生物公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 细胞培养：人卵巢颗粒细胞癌KGN细胞株贴壁生长于10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5