Q开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞病理形态影响.docVIP

Q开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞病理形态影响 　　[摘要]目的：探讨Q-开光1064nm Nd：YAG激光不同能量照射对黄褐斑动物模型表皮黑素细胞病理形态的影响。方法：用Q-开关1064nm Nd：YAG激光不同能量和频率照射黄褐斑动物模型背部皮肤，分别于激光照射前和照射后不同阶段取材，通过HMB45免疫组化染色法，光镜观察豚鼠表皮黑素细胞的变化。结果：第一次激光照射后即刻可见高能量两组黑素阳性细胞减少，第5次激光照射后即刻可见低能高频组黑素阳性细胞减少。与术前比较，低能量密度低频率照射组黑素细胞阳性细胞数无显著差异。5次治疗后软件分析结果显示，高能高频、高能低频和低能高频组与照射前比较黑素细胞阳性目标个数、平均数密度、平均光密度下降，但平均灰度值上升，差异有统计学意义（P0.01）。结论：高能量密度Q-开光 Nd： YAG激光照射对表皮黑素细胞的影响大于低能量密度，当其超过一定阈值时能高能量高频率可导致黑素细胞的损伤和减少。从而为临床应用Q-开关1064nm Nd：YAG激光治疗色素性疾病提供了实验依据。 　　[关键词]激光；黑素细胞；黑素；光镜；动物模型 　　[中图分类号]R758.4+2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）09-0941-06 　　Q-开关激光技术的应用和选择性光热作用原理的提出[1-2]，色素增加性疾病的治疗取得丰硕的成果，对于黄褐斑的治疗虽然疗效也令人比较满意[3-4]，但褒贬不一样，同时还是存在一定的副作用和治疗风险[5]。目前对Q-开关Nd：YAG 激光治疗色素增加性皮肤病机理的认识主要还是选择性光热作用理论的光致破裂作用，而对Q-开关Nd：YAG激光照射可能存在的对表皮黑素细胞生物学和病理形态的影响却并不清楚。黑素细胞是皮肤唯一能合成黑素的细胞， 是多种皮肤色素沉着性疾病的靶细胞，并参与皮肤的免疫反应和光老化的过程。对激光照射黑素细胞的病理形态研究为Q-开关Nd：YAG激光有效用于临床黄褐斑的治疗提供基础实验和理论依据。现将结果报道如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1实验动物：根据文献[6]制作慢性应激抑郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。 　　1.1.2主要试剂和仪器：HMB45 （melanoma 黑素瘤） 鼠抗人单克隆抗体即用型试剂盒（福建迈新公司）；Q-switched Nd：YAG激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司）；光学显微镜（Olympus公司）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1照射方法：取慢性应激抑郁型小鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只小鼠裸露皮肤划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1分钟，每周照射一次，共照射5次。实验设每只小鼠自身激光术前为对照。 　　1.2.2取材方法：分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1.0cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。其中第一次照射前的取材为正常对照。 　　1.2.3 HMB45免疫组化方法[7]：10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。黑色素标记采用免疫组织化学技术-链霉菌素·生物素法，再经脱蜡至水化、抗原修复后，用HMB45（melanoma黑素瘤）为第一抗体，免疫组化二步法，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗做阴性对照。 　　1.2.4 显微镜图像分析[8]：采用病理图像分析系统对目标图像进行定量分析，每张切片随机在显微镜物镜400×下选择5个不重叠视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野中的阳性目标面积、目标个数、平均灰度值等。 　　1.3统计学处理：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异运用方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1肉眼观察：治疗后创面均出现轻微红肿，高能量区针尖样出血，2～3日后逐渐结痴，5～6日后开始脱落。低能量区皮肤微红，高能高频区第三次照射后开始出现点状白斑，其他两组与低能低频区激光治疗区照射后1周豚鼠皮肤颜色相比减淡明显。 　　2.2皮肤黑素细胞的病理形态学观察 激光术前可见豚鼠表皮基底细胞和棘细胞层中可见成簇分布的黑素细胞，呈强阳性反应。第5次照射后即刻可见高能量高频