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不同取材时期和处理方法对瓦松无菌体系建立的影响 　　摘要：以瓦松植株为外植体进行组织培养，探索不同取材时期、处理方法、消毒时间、激素配比等对其无菌体系建立的影响，结果表明，无菌体系建立的材料以5月上旬取材、取材后对材料进行假植处理、剪去新萌生的茎段作为外植体为宜；材料用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min后接种，污染率在5%以下，存活率在92%以上；在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的启动培养基中，芽启动率为99.78%，外植体并没有出现愈伤组织、玻璃化等现象。 　　关键词：瓦松；取材时期；处理方法；无菌体系 　　中图分类号： Q945.52文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0055-03 　　收稿日期：2013-05-09 　　基金项目：河南农业职业学院重点项目（编号：HNAC2011KY002）。 　　作者简介：李庆伟（1979―），男，河南封丘人，硕士，讲师，研究方向为种苗繁育与大蒜生产。E-mail：liqingwei2003@163.com。瓦松（Orostachys fimbriatus）别称瓦花、瓦塔、瓦玉等，为景天科瓦松属2年生草本肉质植物，在河南、江苏等省及朝鲜、日本等国家和地区有分布[1]。瓦松植株中含有多种酸类、景天庚酮糖苷及异丙叉基景天庚酮糖苷等物质[2-5]，主要用于药物合成，目前，利用瓦松参与合成的药品不下27种。在临床上，主要用于治疗宫颈糜烂、肾性皮肤瘙痒、痔疮、口腔溃疡等症状[6-9]。随着研究深入，以瓦松为原材料加工而成的药品，将更多地应用在临床上。自然条件下，瓦松生存完全依靠自生自灭。近年来，由于受气候异常变化、花期采药、生境发生变化等影响，瓦松资源受到严重破坏，保护瓦松资源刻不容缓。目前，国内外并没有发现关于瓦松繁殖，尤其是快速繁殖的研究报道。探索并利用生物技术手段，对瓦松进行种苗繁育技术研究，对深度挖掘瓦松的潜在药用价值，进一步加快瓦松的开发利用具有十分重要的意义。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　供试材料采于当地农村15年以上的瓦房上，分别在2月上旬、5月上旬、7月上旬、10月上旬拔取全株瓦松，用带叶茎段作为接种材料。 　　1.2外植体消毒 　　采用2种外植体选择方法进行消毒。方法1为直接消毒接种：在自来水下清洗表面泥土与灰尘，后剪成3～5 cm长茎段，用自来水冲洗30 min，对2月上旬采集的材料，去根、留莲座状叶和芽，直接用水冲洗；置于超净工作台上用0.1% HgCl2分别浸泡2、4、6、8、10、12、14 min，无菌水冲洗4次，沥干水于无菌纸上。方法2为假植后消毒接种：材料假植于花盆中，套塑料袋，于室内25 ℃下培养5～7 d；剪新萌生嫩茎直接用0.1% HgCl2消毒，消毒时间同上。 　　消毒后茎段，剪成带叶的茎段接种于初代培养基中，每瓶接种1个茎段，每个处理均接种15瓶。 　　1.3材料培养 　　初代培养基，以MS培养基为基本培养基，采用2因素完全随机设计（表1）。培养基采用高压蒸汽灭菌，在121 ℃、1.1 kg/cm2 压力下灭菌15 min。接种材料置于温度24～26 ℃、光照时间14 h/d、光照强度 30 μmol/（m2?s） 的条件下进行培养。 　　1.4数据统计与分析 　　接种后2 d开始调查，后每隔3 d调查1次，记载污染发生的时间、类型、部位，外植体受伤害情况，腋芽初始萌动时间、腋芽萌动程度、材料的生理状态等，接种后22 d统计污染情况，接种后30 d统计材料存活、伤害情况、腋芽萌动等。根据统计结果计算污染率、存活率、启动率等，公式如下：污染率=污染外植体数/接种总数×100%；存活率=存活个体数/接种总数×100%；启动率=萌芽个体数/接种总数×100%。 　　数据用SPSS 13.0软件进行方差分析，采用邓肯氏新复极差测验进行多重比较。试验中全部处理小于1的百分数，经反正弦转换后，进行分析和比较。 　　2结果与分析 　　2.1取材时期和方法对无菌体系建立的影响 　　由图1可见，瓦松取材时期和方法不同，组培苗污染率存在很大差异；2月上旬取材后直接消毒接种（方法1）污染率最高，达100%，10月上旬、7月上旬取材次之；5月上旬取材污染率最低，2种方法平均污染率22.2%。这可能是由于5月瓦松种子萌动后刚开始大量生长，生命力较旺盛，且外植体在空气中暴露时间较短，随着在空气中暴露时间的增加，外植体表面汇集大量微生物，组织培养时直接进行消毒，并不能将表面的微生物全部杀死；进入冬季，瓦松植株为适应环境条件变化，进入休眠，整个植株生长停止，叶片紧紧闭合，体内积累大量微生物，消毒时，消毒剂只能将裸露在表面的微生物杀死，并不能杀死植株内的微生物，从而造成2月