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一氧化氮对灵芝木质素与多糖含量的影响研究 　　摘 要：采用硝普钠（Sodium nitroprusride，SNP）作为外源一氧化氮（nitric oxide，NO）供体，研究一氧化氮对灵芝产量、木质素和灵芝多糖含量的影响。结果表明，5mmol/L SNP处理促进灵芝子实体生长，并显著提高灵芝多糖含量，降低木质素含量；当SNP处理浓度达到20mmol/L时，将抑制灵芝多糖的积累。 　　关键词：灵芝；一氧化氮；木质素；灵芝多糖 　　中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）14-19-02 　　灵芝是一种药食兼用真菌，在我国有着悠久的应用历史。灵芝子实体具有抑制肿瘤、抗血栓形成、防止动脉硬化、提高人体免疫力、镇痛及延迟细胞衰老等功效[1-3]，其主要含有多糖和灵芝酸等其他有效化学成分[4]。与猴头菇、灰树花、姬松茸等肉质化的食药用真菌子实体相比，灵芝子实体含有高达70%以上的纤维素和木质素，使得其不能直接食用，只能通过适当的提取工艺提取多糖和灵芝酸等有效药用成分。然而，提取过程复杂，且有效成分有损失、提取不完全，从而大大限制了子实体的药用价值和灵芝产业发展。因此，如何降低灵芝木质素含量一直是灵芝产业所关注的重要课题。本文采用生物信号分子一氧化氮（NO）供体硝普钠作为灵芝子实体生长过程中次生代谢产物调节剂，研究一氧化氮对灵芝木质素和多糖含量的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 灵芝菌种（Ganoderma lucidum）由上海农科院食用所提供。蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、乙醇、蛋白胨、葡萄糖、硝普钠（Sodium nitroprusride，SNP，购自Sigma公司）、氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸、浓硫酸、琼脂、苯酚、酒石酸钾钠、无水硫酸钠。 　　1.2 仪器与设备 JA2003N型电子分析天平、756-MC型可见分光光度计、YXQ-LS50S11立式压力蒸汽灭菌器、HZ-300L恒温摇床、HH?B11?420-S电热恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、HH-6恒温水浴锅，SW-CJ-2FD双人单面净化工作台、XHF-D高速分散器、北京博医讯冷冻干燥机。 　　1.3 方法 　　1.3.1 灵芝栽培与处理 采用棉籽壳44%，杂木屑44%，麸皮5%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏粉1%配方配制培养基。选用500mL罐头瓶栽培，每瓶装干料150g，常规灭菌接种后，于25℃左右条件下培养，经20d发菌培养，当菌丝长至1/2瓶时，可以除去封口纸，搬至子实体发生室。此时控温25～28℃，相对湿度增至90%～95%，保持空气清新，增强漫射光。待长出菇蕾时每隔4d用0、0.5、1、5、10、20mmol/L浓度的硝普钠（NO供体）进行表面喷施，每组重复10瓶，共处理10次。在弹孢期后采收子实体，并测定相关指标。 　　1.3.2 木质素含量测定 子实体于60℃烘箱烘干后粉碎，过40目筛后，用于测定灵芝木质素含量。木质素含量的测定参照鞠志国等的方法[5]。按1∶10（W/V）加入沸水，冷却后加入86%硫酸25mL，室温下充分搅拌4h，加入250mL dH2O煮沸1h，冷却后用烘干至恒重的砂芯滤斗抽滤，用60℃热dH2O洗涤至洗液与10%BaCl2反应时不出现沉淀为止，砂芯滤斗烘干后称重。按以下式计算木质素含量： 　　木质素（%）=[（抽滤后漏斗重-抽滤前漏斗重）/样品重]×100 　　1.3.3 灵芝多糖提取与含量测定 （1）灵芝多糖提取。采集子实体，60℃烘箱烘干后粉碎，过40目筛后，用于测定灵芝多糖含量。称取0.100g，加入5mL1mol/L NaOH，60℃水浴1h，然后6 000rpm离心10min，取上清液，得多糖样品粗提液。再用Sevag法除去蛋白，在4℃用去离子水透析24h、60℃旋转蒸发器浓缩、-45℃真空冷冻干燥36h。（2）灵芝多糖含量的测定。称取标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至250mL制成40μg/mL葡萄糖标准液。取试管分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液，用ddH2O补齐至2.0mL；加入6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%浓硫酸5.0mL。混匀后于485nm测定光密度值。以葡萄糖含量（μg）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y），作出葡萄糖标准曲线y=0.009 1x-0.006 7，R2=0.993 6。取0.1mL多糖提取液，加入1.9mL ddH2O、6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%浓硫酸5.0mL，混匀后于485nm测定光密度值。按标准曲线计算多糖含量。 　　1.3.4 灵芝产量测定 在弹孢期后采收，用电子天平称取子实体质量。 　　1.3.5 数据统计 本实验各处理重复3次，试验结果均以