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不同沉淀方法对外源表达凝乳酶活性的影响 　　摘要：从粗提重组凝乳酶的得率、保存活性2个方面比较了乙醇沉淀法和硫酸铵沉淀法的差别。结果表明，相对于硫酸铵沉淀法，乙醇沉淀法获得蛋白的量相差不是很大，但是乙醇沉淀法所获得蛋白的单位效价是硫酸铵沉淀法的1.27倍，且乙醇沉淀法所得产物的比活性提高了16.78%。综合考虑重组凝乳酶的得率与活性，用乙醇沉淀的效果较好。 　　关键词：重组凝乳酶;活性;乙醇沉淀法;硫酸铵;盐析 　　中图分类号： Q814.1 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）04-0050-03 　　收稿日期：2014-05-08 　　基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划（编号：102300410146）。 　　作者简介：邓培渊（1981―），男，河南登封人，博士，讲师，主要从事动物分子生物学研究。E-mail：zhzd201@。 　　凝乳酶原一般存在于反刍动物的第4胃中，在酸性条件下经自我剪切形成有活性的凝乳酶。凝乳酶属于酸性蛋白酶，主要功能是水解Κ-酪蛋白的Phe 105-Met 106键，在室温以上并有Ca2+存在时，可使蛋白质凝聚成乳块，因而在奶酪生产和改良中有重要的应用价值[1]。目前，凝乳酶的替代品主要来源于动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶以及重组凝乳酶。常见的动物胃蛋白酶主要存在于幼猪[2]、小鸡、金枪鱼以及鲨鱼中[3-5]，但是这些动物的胃蛋白酶与小牛凝乳酶仍有所不同。在多种植物的不同部位中可以分离到使乳凝固的蛋白酶，即植物凝乳酶[6]。在合欢树、无花果、新鲜木瓜中提取出的蛋白酶以及姜汁、柠檬汁等植物非蛋白酶均有较好的凝乳作用，因此具有广阔的商业价值[7-10]。 　　微生物凝乳酶主要来源于细菌、放线菌和真菌，由于微生物凝乳酶具有耐热性强、不易失活的特点，在实际生产中需要进一步调整工艺促使凝乳酶失活。研究发现，基因工程凝乳酶同天然凝乳酶的性质基本相同，利用基因工程生产的凝乳酶不仅纯度高、产出的奶酪品质好，而且易于工业化生产，因此重组凝乳酶具有重要的实际应用价值[11]。 　　要对外源表达的凝乳酶进行分离纯化，获取有活性的目的产物，纯化的第1步就是对发酵液进行浓缩，在去除杂质的同时，可以获取高活性的凝乳酶。目前粗提外源表达凝乳酶常用硫酸铵沉淀法或乙醇沉淀法，不同的粗提方法直接影响凝乳酶的活性和纯化效果。本研究对外源表达重组凝乳酶的初步浓缩方法进行比较分析，以期为工业化生产提供一定的理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验材料为重组菌株km2，由笔者所在实验室构建并保存。 　　1.2 培养基 　　100 mL YEPD培养基配方：1 g 酵母提取物，2 g 葡萄糖，2 g 蛋白胨，加去离子水至100 mL，于120 ℃灭菌30 min（固体培养基在此基础上添加1.5%～2.0% 琼脂）。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 粗酶液制备 挑取单菌落转接于YEPD固体培养基上，于28 ℃培养28 h后，挑取单菌落接种于50mL种子培养基中，于28 ℃、250 r/min条件下培养20 h，以5%的接种量接种于95 mL发酵培养基中，再于28 ℃、180 r/min条件下培养约96 h，冷冻离心（4 ℃、8 000 r/min、15 min）后取上清，4 ℃冰箱保存备用。 　　1.3.2 硫酸铵沉淀法 取6组500 mL粗酶液，分别加入硫酸铵至饱和度分别为10%、20%、40%、60%、80%、100%，混匀后于4 ℃过夜，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，弃上清，将沉淀溶于0.05 mol/L、pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中，即得粗酶液。测定重组凝乳酶活力及蛋白含量，计算回收率。 　　1.3.3 乙醇沉淀法 取500 mL粗酶液，按不同体积比分别缓慢加入预冷乙醇中，4 ℃沉淀过夜，8 000 r/min离心 15 min，弃上清，将沉淀溶于0.05 mol/L、pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中，得到粗酶液;4 ℃沉淀2 h，8 000 r/min离心 15 min，弃上清，将沉淀溶于0.05 mol/L、pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中，得到粗酶液。测定重组凝乳酶活力及蛋白含量，计算回收率。 　　1.3.4 重组凝乳酶原十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）电泳分析表达产物 以发酵培养基作为参照物，将硫酸铵沉淀、乙醇沉淀所得的粗酶液通过SDS（12%）电泳检测表达产物[12]。 　　1.3.5 凝乳酶活性测定方法 用1 mol/L H2SO4将粗酶液的pH值调整至2.0，室温条件下放置2 h，然后用2 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）调上清液的pH值至6.0。采用Arima等的方法[12]进行凝乳酶