云南文山竹丛枝病检测及16S rDNA 片段序列分析.docVIP

云南文山竹丛枝病的检测及16S rDNA 片段序列分析 　　摘 要：用植原体16S rRNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2，对表现丛枝的竹子植株总DNA进行直接PCR及巢式PCR扩增，得到长1.2 kb的目的片段。经过克隆测序比较分析，结果表明其属于16Sr I-B亚组。 　　关键词：云南；竹丛枝；16s rDNA 　　竹是禾本科竹亚科Bambusoideae植物的总称。竹子是具有极高的观赏性的一种经济作物，其形态优美，常作为景观观赏、道旁植被、公园植物[1]。云南文山州地处云贵高原东南部，属于亚热带气候，该地区水热资源较丰富，年温差小，日温差大，比较适合竹子的生长。 　　竹丛枝病又名“扫帚病”，“竹簇叶病”，在韩国、印度以及中国许多省市均有报道[2-4]。感病植株生长势弱，出笋减少，严重的病竹常常会枯死，竹材质量严重下降。随着竹林面积迅速扩大，该病的危害越来越严重，已成为竹子上最常见的严重病害之一[1，5]。早期的研究认为竹丛枝病是有瘤座菌[Aciculosporium take Miyake，Balansia take（Miyake） Rlara]真菌引起的病害[6]。然而许多植物丛枝病均被证实由植原体引起，随着分子生物学研究技术的进步，通过PCR扩增可以快速鉴定植物材料中是否含有病原，本研究采拟采用PCR技术对文山表现丛枝症状的竹子植株进行植原体分子检测，并对扩增得到的16S rDNA片段进行克隆及测序，并与已知的竹丛枝植原体16S rDNA进行序列同源性比较，确定其植原体株系的分类地位，并初步比较其各株系间的差别。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料来源与主要试剂 　　竹子材料采自云南文山州广南县冷水沟，海拔1200m。材料于-80℃保存备用。基因组DNA提取试剂盒来自百泰克生物技术有限公司，DNA Marker、Taq酶、Amp、IPTG等试剂购自北京金式金生物科技有限公司。pMD19-T购自宝生物TaKaRa。 　　1.2 材料总DNA提取 　　取材料0.5g，剪碎放于研钵中，加入液氮，研磨3-5次，直至成细粉状。参照植物基因组DNA提取试剂盒的方法，提取植株总DNA干燥后溶于EB buffer溶液，于-20°C下冷冻保存备用。 　　1.3 PCR扩增 　　选用植原体16S rDNA通常用的引物P1/P7和R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增：25μL体系，10 x Easy Taq Buffer 2.5μL ，dNTP 2μL，引物各0.5μL，Easy Taq Polymerase 0.25μL，DNA 模板1μL。PCR反应程序：预变性94℃ 5min，变性温度94°C 1min，复性温度48°C 1 min，延伸温度72°C 2 min，总共30次循环，总延伸10min。巢式扩增程序为：预变性94℃ 5min，变性温度94°C 1min，复性温度55°C 1min，延伸温度72°C 1min 30 s，总共35次循环。扩增产物在1?琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样3uL，用凝胶成像系统观察并拍照记录。 　　1.4 PCR扩增产物的纯化、克隆、酶切鉴定以及序列测定 　　在紫外透射仪上切下含目的PCR产物琼脂块，用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（昆明硕阳科技有限公司），琼脂块凝胶上回收目的片段，在含有IPTG和X-gal的LB筛选平板上挑取白色菌落摇菌培养12小时，提取重组质粒DNA ，经过酶切和跑电泳检测之后，筛选出正确的质粒DNA经过克隆送去上海生工生物技术有限公司进行测序。 　　1.5 16S rDNA核酸序列同源性比较和酶切位点分析 　　采用DNAMAN 6.0、MEGA5.0等生物软件，分析所测序列的含量，将测定到的序列与植原体组中各个具有代表性植原体的 16S rDNA基因序列进行比较。 　　2 结果与分析 　　2.1 感病植株的症状表现 　　感病植株明显表现为丛枝症状，枝条先端枝条簇生，簇生节间变短，分枝增多，丛生成鸟巢状，叶片呈现黄化（图1）。 　　图1 感病植株丛枝症状图 　　2.2 PCR扩增结果 　　感病植株通过液氮提取总DNA，经巢式PCR 扩增，结果获得大小约1 200 bp 的16S rDNA 片段（图2），片段大小与预期大小相符，而健康对照未出现特异扩增带。说明该丛枝样品中确有植原体存在。 　　图2 PCR 电泳检测图（M：Maker； 1为健康植株；2，3 为巢式PCR扩增的两个不同重复） 　　2.3 16S rDNA序列分析 　　将扩增到的1 200 bp左右大小的特异片段经割胶纯化后，连接pMD19-T，转入大肠杆菌DH5α，涂板后挑取重组克隆，经PCR验证正确的克隆子送上海生