二种大实蝇PCRRFLP快速鉴定方法.docVIP

二种大实蝇的PCR-RFLP快速鉴定方法 　　摘　要　应用PCR-RFLP技术，对我国部分地区发生分布的蜜柑大实蝇和橘大实蝇开展了分子生物学鉴定方法研究。结果表明，利用4组引物对目标实蝇的COⅡ和ITS1基因进行PCR扩增，并借助MnlⅠ，MseⅠ，AseⅠ，DraⅠ和SspⅠ等5种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，能从多个途径把2种大实蝇区分开。所建立的方法不受目标实蝇食物源、地理来源和标本保存条件的影响，对不同虫态和不同性别的个体均适用，可在生产和检疫实践中对蜜柑大实蝇和橘大实蝇进行快速鉴定。 　　关键词　蜜柑大实蝇，橘大实蝇，PCR-RFLP，COⅡ，ITSI 　　 　　蜜柑大实蝇Bactrocera(Tetradacus)tsutteonis与橘大实蝇Bactrocera(Tetradactts)minax属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae寡毛实蝇属Bactrocera大实蝇亚属rctradacus，是国际上关注的危险性害虫，同时也是我国重要的国内检疫对象。 　　蜜柑大实蝇和橘大实蝇在我国主要柑橘产区如广西、贵州、四川、湖南等局部地区均有发生和分布。这2种大实蝇的外部形态十分相似，长期以来，主要是以成虫体上的鬃序分布及其数量和雌虫的产卵器特征作为区分依据。但是，成虫体鬃的分布及其数量在个体间常有变异，这给鉴定，尤其是雄成虫的鉴定带来一定的困难。此外，2种大实蝇从卵饲养至成虫均需经历160～200d的漫长的蛹期，这使它们的幼体更是难以鉴定。然而，2种大实蝇都主要以幼虫蛀果为害，并主要以卵、幼虫和蛹随寄主果实、土壤或运输工具作远距离传播，所以，在实际生产和检疫工作中更常见的却是对实蝇幼体的鉴定。 　　目前，有关蜜柑大实蝇和橘大实蝇快速鉴定方法的研究仅见于汪兴鉴等的报道，他们利用血淋巴蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳成功区分了大实蝇的3龄幼虫，然而，该方法只局限于对大实蝇3龄幼虫的鉴定，因此在推广应用上受到限制。本研究拟从分子生物学角度，借助PCR-RFLP分子标记技术探索2种大实蝇快速鉴定方法，以满足生产和检疫实践的需求。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　供试标本 　　本实验所用的大实蝇标本是来源于广西、湖南等柑橘产区的新鲜、烘干和酒精浸泡标本，参照汪兴鉴等报道的方法对大实蝇进行形态学鉴定。 　　 　　1．2　主要试剂 　　1．2．1　引物：实验所用引物详见表1。其中，FFCIQPA和FFCIQPC 2对引物根据相关实蝇线粒体DNA(mtDNA)COⅡ序列设计；引物baITSlf、BcucomR和DacusR则根据相关实蝇核糖体DNA(rDNA)ITSI序列设计。引物皆由上海博亚生物技术有限公司合成。 　　1．2．2　酶及其他试剂：实验所用的Taq酶、PCR反应体系试剂(dNTPs、10×buffer和Mg2+)、琼脂糖、EB均购自华美生物工程公司。100bp和41bp Ladder Marker分别购自日本TOYOBO公司和北京鼎国生物技术有限责任公司。限制性内切酶MnlⅠ，MseⅠ，Ase工和SspⅠ购自英国BioLabs公司，DraⅠ购自日本TOYOBO公司。 　　 　　1．3　方法 　　1．3．1　DNA提取：切取供试实蝇部分个体，放人1.5mL微离心管中，加入一定量的提取缓冲液A(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA，60mmol/L NaCl，50％蔗糖)，用烧熔后的枪头将样品磨碎，然后加入等体积的缓冲液B(300mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100mmol/LEDTA，0.1V10％SDS，50％蔗糖)，冰浴10min。加入等体积的苯酚，混合后离心5min，离心条件为4℃，14000r/min(下同)。吸取上清液，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇混合液，混合比例为25:24:1，混合后离心5min。吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇混合液(24:1)，混合后再离心5min。吸取上清液，用2倍体积的冷冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L醋酸铵溶液沉淀，置于-20℃冷冻30min以上。冷冻后取出，离心20min，弃去上清液，用70％乙醇洗沉淀物1次，弃去乙醇。风干，加入1×TE30至100μL，4℃下保存备用。 　　1．3．2　PCR扩增反应：PCR扩增体系包括：1.5×Buffer，dNTPs(0.2 mmol/L)，引物(各0.4μmol/L)，Mg22+(1.5mmol/L)，DNA 1μL，Taq酶1U，加ddH20至总反应体积达25μL。 　　PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性45ee，5℃退火60sec，72℃后延伸90see，35个循环后，72℃后延伸10min。