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人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 　　摘要：目的 分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs），体外观察其生长特性。方法 采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物。结果 纯化的hBMSCs贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增殖能力，流式细胞仪分析P3代hBMSCs稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73，CD90和CD105等。结论 本实验分离培养的hBMSCs具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记。 　　关键词：骨髓间充质干细胞；分离；培养；鉴定 　　Cultivation and Identification of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells 　　HUANG Mei-juan 　　（Qingdao Central Hospital，Qingdao 266042，Shandong，China） 　　Abstract：Objective To isolate and culture human bone marrow derived mesenchymal stem cells（hBMSCs），and to observe biological characteristics of hBMSCs. Methods Bone marrow mononuclear cells were separated by the method of density gradient centrifugation and MSCs were obtained by adhere culture.The cell morphology and their growth characteristics in vitro were observed under an inverted phase contrast microscope and the cell cycles were tested by flowing cytometry. Mesenchymal like stem cells were identified by surface marker with flow cytometry.Results hBMSCs were adhered like a fibroblast morphology and with pool like growth alinement.Flow cytometry showed that the third passage cells were positive for CD73，CD90and CD105 expression.Conclusion The MSCs from bone marrow in this study show great capability of proliferation. 　　Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Separation；Culture and identification 　　间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞。骨髓是MSCs的主要来源之一，由于其获取途径的便利和对组织损伤小等优点而格外受到重视。从成人髂棘处分离出的MSCs仅占骨髓中单个核细胞的1/106～1/105；但在体外可以分离培养和大量扩增，并能保持细胞表型和多系分化潜能稳定。为了更好地利用MSCs，本研究发展了一种简便有效的从成人骨髓分离纯化MSCs的方法。 　　1 材料与方法 　　1.1主要试剂及仪器 DMEM培养基，10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）；25cm细胞培养瓶（Coning公司）；胰蛋白酶、荧光标记小鼠抗人CD34和CD45表达阴性，CD73，CD90和CD105（Sigma公司）；人淋巴细胞分离液（1.077g/ml，天津TBD公司）；流式细胞仪、离心机（Beckman公司）；550型酶标仪（BIO-RAD）。 　　1.2抽取骨髓和分离间充质干细胞 骨髓来源于本院非血液病患者，无菌抽取5ml骨髓液并肝素化，与等量体积、含10%胎牛血清的L-DMEM培养液混匀，置于Ficol1分离液（比重1.077）上，2000r/min离心20min，离心后收集白膜层中的单个核细胞，以含10%FBS的L-DMEM培养液重悬细胞并进行计数，以1×106/ml的密度接种于25ml的培养瓶中，