MMP-9、TIMP-1在系统性硬皮病皮损中的表达.pdfVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 材料与方法 1 研究对象 1、1 标本来源 收集 2004 －2006 年 SSc 21 例和 LSc 21 例，均为华中科技大学 同济医学院附属协和医院皮肤科门诊或住院患者。所有组织均经临床与组织病理检查 确诊,符合美国风湿协会的诊断标准[15] 。 1、2 临床资料 21 例 SSc 患者中男 6 例，女 15 例，年龄 12－64 岁，平均年龄 40.3 岁，病程 47 个月。21 例 LSc 患者中男 8 例，女 13 例，年龄 16－58 岁，平均 38.7 岁，病程 62 个月。所有患者近一月内未接受系统治疗。正常皮肤主要来源于我院整 形外科门诊手术，男 4 例女 6 例，年龄与硬皮病患者相当，均无系统性疾病或其他皮 肤病。 所有收集蜡块经福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，厚度 5µm，取 3 张切片， 其中一张做 HE 染色作 HE ，其余两张用于免疫组化 S-P 法检测 MMP-9, TIMP-1 。 2 实验方法 2 、1 主要仪器设备 A O 切片机 德国 LEICA 公司 电热恒温箱 重庆实验设备厂 ZD-IIIB 型医用微波炉 上海中达医学研究所 GBS 恒温水浴振荡器 哈尔滨科学仪器厂 光学显微镜 日本 Olympus HPIAS-1000 高清晰度彩色 华海医疗信息技术股份有限 病理图文分析系统 公司 4 ℃ 冰箱 显微摄像系统 日本 Olympus 20 μl、50 μl、100 μl、200 μl 法国 GILSON 加样器 BS 系列电子天平 北京赛多利斯天平有限公司 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 、2 主要试剂 鼠抗人MMP-9, TIMP-1 和免疫组化染色试剂盒均购于武汉博士德生物工程公司， MMP-9, TIMP-1 均为浓缩型抗体，工作浓度为 1：100。 2 、3 主要实验方法 2 、3、1 石蜡标本切片及染色 （1）用石蜡切片机将皮肤组织蜡块 5 μm 切片、摊片、贴片、37℃ 烤片 2 小 时。 （2 ）将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ脱蜡 5~10 分钟。 （3 ）二甲苯Ⅱ脱蜡 2~10 分钟。 （4 ）将脱蜡的切片从二甲苯Ⅱ移入无水乙醇Ⅰ，1~5 分钟。 （5 ）无水乙醇浸泡Ⅱ1~3 分钟。 （6 ）将切片从无水乙醇Ⅱ中移入95%乙醇内浸泡 1~3 分钟。 （7 ）移入 80% 乙醇内浸泡 3 分钟。 （8 ）自来水冲洗切片上的乙醇。 （9 ）蒸馏水清洗切片以防止污染苏木素染液。 （10）苏木素染液染色 5~15 分钟。 （11）自来水洗 3~5 分钟。 （12）1%盐酸酒精分化 3~10 秒。 （13）自来水洗 1~5 分钟。 （14）1%氨水溶液返蓝