7-氨基头孢烷酸酶法生产的研究.pdf

第1章绪论 kDa的 每个亚基含有～个非共价结合的FAD。nDAAO能够形成分了量为170 and 四聚体，商浓度下会形成更高聚集体(Sehrader Andreesen，1996a)。 1。1．4 DAA0底物特异性 不同来源的DAAO有着自己的特异性底物。为了方便比较，以过氧化氢酶 和邻联j：茴香胺结合产生的过氧化氢的景测定DAAO活力((；abler,eta1．．2000)。 底物是D-Proline(Gabler,eta1．，2000)，而来自C．boidinii的DAAO最适底物是 D-Ala(Yudmoto，etal．，2001)· 表I．1不同来源DAAO的性质差别 Table1．1CharacteristicsofDAAOfromdifierent$OUte器 注：rL d表示没有数据 比较不同来源的DAAO，发现TvDAAO对CPC有较高亲和性，因此更适合 8．0，0．21mM氧气条件下，以D-Phe， 7-ACA酶法生产的工业应用。在37。C，pH 和6．5 and mM(Sehrader Andree∞n．1996b)。 1，1．5 DAA0热稳定性和pH稳定性 将pkDAAO、RgDAAO的重组酶以及nDAAO天然酶分别在不同温度下保 温30 4 第1章绪论 a1．，2004)。pH值变化对DAAO的稳定性影响较大，40。C，当pH从8．0下降至 h。而在相|一时问内TvDAAO活力只下降了lO 7．5时，RgDAAO的半衰期只有8 ％(Betancor,etal。2003)。 单聚体pkDAAO，二聚体的RgDAAO和TvDAAO在失活过程中存在不同 mg／ml下 机制。pkDAAO失活与酶浓度没有必系。当RgDAAO的酶浓度从O．15 降到O．05 h变成45rain(Betafleor,et mg／ml时，该酶半衰期从8 a1．，2003)。通过 蛋白质工程技术将RgDAAO突变成单体时，结果该酶热稳定性大幅降低，Tm值 下降了5-6 oC(Pollegioni，eta1．，2003)。 同样，TvDAAO热稳定性也与酶浓度相关，在20．22。C，pH8．0条件下，几 天内TvDAAO活力会丧失，当温度上升至52．60oc时，随着时间增加，TvDAAO 失活速率呈指数l-．升(Betancor,Jetal。2003)。 l，1．6 DAA0基因克隆和表达 DAAO是最早发现的结构典型的黄素蛋白酶，人们通过直接发酵野生菌或 借助基因工程菌来表达DAAO，如表1．2所示。猪肾的DAAO在大肠杆菌诱导 型pET系统中表达时，该酶可溶性蛋白量达到总蛋白量的40％。微生物来源 DAAO最早被克隆出来的宿主菌是Fusarium solanii(isogai，etal，1990)，随后在 1997年，三角酵母和红酵母来源DAAO先后被克隆．由于在测定DAAO活力过 程中存在pH，温度和底物差别，难以直接比较重组菌表达量的高低。重组大肠 杆菌表达DAAO主要采用组成型表达和诱导型表达两种方式，结果发现诱导型 启动子表达DAAO要强于组成型启动子。TvDAAO编码基因在醇氧化酶 (Alcohol oxidase，AOXI)启动子控制下的毕赤酵母中得到高效表达，重组菌最 高发酵单位达到23000 U／L(Yu，cta1．。2002)。 利用重组微生物进行