有机磷农药毒死蜱降解菌的筛选及生理生化特性研究.docVIP

有机磷农药毒死蜱降解菌的筛选及生理生化特性研究 　　摘 要：本文采用微生物修复农药污染的方法，从武汉市江夏区长期受有机磷农药污染的土壤中驯化、分离、筛选出几株生长最具优势的降解有机磷农药毒死蜱的菌株，分析和研究了单菌株和复合菌株对土壤的降解效果。实验结果表明，在7种组合和2个空白对照的对比下，AB菌株组合成为最佳组合降解菌，证明在实验环境中确实存在菌种间的相互作用来促进其对农药的降解，且降解效果明显。另外，研究了不同温度、PH值、碳源、氮源等环境因子对优势菌株生长的影响。 　　关键词：毒死蜱;农药残留;降解;复合菌株 　　中图分类号：S182 文献标识码：A 　　1 引言 　　毒死蜱（Chlorpyrifos），即氯吡硫磷，作为一种中毒性有机磷杀虫剂类农药， 作用效果好，药效持续时间长，在我国乃至世界都有着广泛的使用，目前逐渐替代高毒性有机磷农药。在施用中，会残留于土壤、水、作物叶片上。如果不及时处理，会随着挥发性和移动性富集于生物体内，最后随着生物链进入人体，危害人体健康。目前对于农药污染的研究有很多，对毒死蜱也是如此。通过对他人研究成果的分析，笔者发现“研究过多的集中在一种高效降解菌的提取和研究”，即人们研究的高效降解菌株多局限于一株，然而单一的菌株易受土壤环境和土著微生物的影响，降解效率极易下降，并且土壤中的微生物环境极其复杂，降解农药污染不是一株降解菌就可以降解到人们满意的效果。笔者从长期使用受机磷农药污染的农田取样，以含有毒死蜱农药的培养基筛选耐性菌株。通常情况下，在较高浓度的培养基中会出现多种耐性菌种，在多次循环使用农药培养基培养后，菌种会逐渐稳定，其中极有可能出现含有毒死蜱抗性的降解菌株。然后通过组合培养可以确定复合菌株能否提高分解效率，以期证明环境中确实存在菌种间的相互作用来促进其对农药的降解，研究结果可以为农药污染的土壤生物修复相关研究提供一定的依据。 　　2 材料与方法 　　2.1 实验材料 　　土样：取自江夏区长期受有机磷农药污染的田地中，风干，避光保存。 　　农药：毒死蜱（美国陶氏益农公司登记注册） 　　2.2 试剂及设备 　　（1）试剂 KH2PO4，MgSO4?7H2O，（NH4）2SO4，蔗糖，HCl，NaOH，革兰氏染色试剂，琼脂，牛肉膏，乙酸乙酯。 　　（2）仪器设备 PGX-250多段光照培养箱（宁波）;UV-1800紫外-可见分光光度计（日本）;奥林巴斯BX51显微镜（日本）;光照恒温摇床（上海）。 　　（3）富集培养基（液体）配方：K2HPO4?3H2O 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4?7H2O 0.2g，（NH4）2SO4 0.5g，蔗糖10g，水1000mL，PH 7.0。 　　（4）牛肉膏蛋白胨培养基（液体）配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水 1000mL，PH 7.5。 　　（5）农药储备液：准确移取毒死蜱农药，用乙酸乙酯为溶剂配制成质量浓度为0.5g/L的毒死蜱农药储备液，于冰箱中保存，使用时根据实际需要配置成不同浓度的标准工作液。 　　2.3 实验方法 　　 2.3.1 菌种的筛选、分离和提纯方法 　　土壤样品来自江夏区纸坊附近的农田，取2g新鲜土壤加入98g蒸馏水，摇匀制成悬浮液。取悬浮液的25%加入到含有一定量毒死蜱的培养基中，放入摇床中震荡培养，30℃，100r/min转培养48小时。48小时后移取悬浮液500微升于50mL含有一定量的毒死蜱的培养基中，然后在摇床继续培养48小时，条件一致，重复3次。采用平板划线法分离菌种，通过多次分离，在显微镜下观察细菌形态确定得到三株优势菌种，暂命名为A菌，B菌，C菌，分别挑取A、B、C，接种于50mL富集培养基中，30℃，120r/min，振荡培养24h（富集培养），得到三种纯的菌液备用。 　　 2.3.2 不同组合菌株降解毒死蜱的土壤模拟实验方法 　　实验土壤取回后风干过40目筛备用。采用a、b、c三个处理组，每个处理组重复两次。向每个锥形瓶中加入50 g土壤，25mL水，作如下处理： 　　a 组：1、灭菌、加入A菌悬液6mL、农药储备液2mL;2、灭菌、加入b菌悬液6mL、农药储备液2mL;3、灭菌、加入c菌悬液6mL、农药储备液2mL;4、灭菌、加入a、b菌悬液各3 mL、农药储备液2mL;5、灭菌、加入a、c菌悬液各3 mL、农药储备液2mL;6、灭菌、加入b、c菌悬液各3 mL、农药储备液2mL;7、灭菌、加入a、b、c菌悬液各2 mL、农药储备液2mL; 　　b 组：灭菌、未加入菌悬液，加入农药储备液2 mL; 　　c 组：未灭菌、未加入菌悬液，加入农药储备液2 mL。 　　其中，b、c两组均为空白对照组，b组为了测定土壤和