利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因miRNA.docVIP

利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因miRNA 　　摘要：为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）增殖的候选miRNA，为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）防治及猪的抗病育种提供新策略，通过3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息学分析发现其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现，与阴性对照组相比，miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可极显著（P0.01）抑制荧光素酶的相对活性，其中miR-181d抑制效果最佳。 　　关键词：双荧光素酶报告系统；miRNA；CD163基因；猪 　　中图分类号：R318； Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4854-05 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.19.052 　　Abstract： CD163 gene is one of the most important PRRSV entry mediators， which determines the cell susceptibility for PRRSV. If we can identify the miRNAs inhibiting CD163 gene expression， the anti-PRRSV miRNAs can be further acquired. In the present study， we got the full porcine CD163 3′UTR sequence by 3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends） sequencing， and found that it existed targeting sequences of miRNA，including miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262，by bioinformatics analysis. The results of dual luciferase reporter assay showed that miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262 could significantly reduced the related luciferase activity of reporter construct compared with the NC control group （P0.01）， especially for miR-181d. These results indicated that the 4 miRNAs could directly target to porcine CD163 gene，which layed a foundation for the further screening of anti-PRRSV miRNAs in the future. 　　Key words： dual luciferase reporter system； miRNA； CD163 gene； pig 　　猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害极大的传染性疾病，因发病猪耳部发绀呈紫红色斑块状，又称蓝耳病，主要导致母猪繁殖障碍（流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等）、各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等[1]，造成巨大的经济损失。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用感染易感细胞[2]，因此这些特异性受体存在与否决定了细胞对PRRSV的易感性。CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体之一，参与介导病毒的内吞和增殖。 　　CD163是一种清道夫受体（Scavenger receptor），在PRRSV感染宿主细胞中起重要作用，主要参与病毒脱壳和基因组RNA的释放过程。在PRRSV非易感细胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中转染CD163真核表达质粒可以使这些细胞系感染 PRRSV 并在细胞内产生子代病毒粒子[3，4]。CD163的表达量高低与PRRSV复制效率呈正相关，上调CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163表达可降低病毒增殖[5]。猪肺泡巨噬细