利用超薄层等电聚焦电泳技术对燕麦种子进行蛋白多态性和品种鉴定方法研究.docVIP

利用超薄层等电聚焦电泳技术对燕麦种子进行蛋白多态性和品种鉴定方法研究 　　刘敏轩　王?文　阎建锋 　　摘 要：本文探索研究了利用超薄层等电聚焦电泳进行燕麦品种鉴定所需的各种试验条件。结果显示：燕麦种子贮藏蛋白以醇溶蛋白为主，水溶蛋白次之，盐溶蛋白最少，因此应将醇溶蛋白作为燕麦品种鉴定的生化标记；一次性提取法与分步提取法相比，步骤较为简单，需时短，所得电泳谱带较多，更适用于燕麦种子蛋白提取；4种醇溶蛋白提取液中，以1％(v／v)巯基乙醇+lmol/L(W／V)尿素+乙二醇溶液所得电泳效果最佳，确定其为燕麦种子醇溶蛋白提取液以进一步研究。 　　关键词：超薄层予电聚焦电泳技术燕麦品种鉴定 　　燕麦是一个适应性强，产量较高的粮、饲兼用作物，在我国种植历史悠久，遍及山区、高原和北部高寒冷凉地带。主要种植在内蒙古、河北、山西、甘肃4个省、自治区，种植面积约占全国总面积的90％，产量已达1500万t左右。同时，燕麦也具有营养价值高、医疗保健价值高和饲用价值高等优点。因此，保证燕麦优良品种种子的真实性及纯度对我国的农牧业的发展、规范燕麦种子销售市场、维护燕麦种子消费者的合法权益以及保护国家和农业的利益不受损失等各方面均具有很重要的意义。许多专家学者在这方面已作了许多工作。 　　超薄层等电聚焦电泳是一种较为先进的品种真实性鉴定方法，目前已成功应用于玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeum vulgate)等农作物品种鉴定中，而用此技术进行燕麦品种真实性鉴定，目前，国内还没有相关报道。本文使用超薄层等电聚焦电泳技术对5个燕麦品种的水溶、盐溶、醇溶性蛋白进行了研究分析，以确定和建立用此项技术为燕麦品种进行鉴定的试验条件，为其尽快应用于实际检验工作奠定基础。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1 材料 　　试验材料包括5个燕麦品种，其名称和来源见表1。 　　 　　1．2 方法 　　1．2．1 电泳方法。采用超薄层等电聚焦电泳技术(UTLlEF)进行试验。凝胶制备采用平板法，使用125mm×260mm×3mm规格的玻璃板两块，并在其中一块玻璃板的两条长边上黏上厚度0．15mm的电工绝缘胶带，作为制胶模具，以OelBond FAG(Pharmacia Biotech生产)为支持膜制备凝胶。将配置好的凝胶液6．5ml[内含凝胶贮存液5ml、尿素1．68，Sinulyl PH2―9(德国slflus公司生产)440μ1、20％APS35μ1、TEMED5μ1]倒在支持膜上，小心的将涂有疏水硅烷的玻璃板盖上，尽量避免产生气泡，静置聚合45 min以上。待凝胶完全聚合后打开模具，取出凝胶，准备电泳。将制好的凝胶放在水平电泳槽中预先冷却(10℃)的玻璃板上，欲使凝胶粘附冷却得更好，可在凝胶和板之间置一层水。每块凝胶用3条电极条，两端的电极条涂正极液，中间的电极条涂负极液，加样条放置于正极条约lcm处，然后加样(约15μ1)于正极端，电极芯对应电极条安放好，以2500V，15mA，40W条件聚焦70min，直至完成聚焦。电泳结束后，取出凝胶浸入固定液，并缓慢摇动30min，然后将凝胶转入染色液中摇动染色50min，在凝胶脱色液中浸15min，直至脱色干净。 　　1．2．2 种子贮藏蛋白提取。分别采取一次性提取法和分步提取法对参试种子进行水溶蛋白、盐溶蛋白和醇溶蛋白的提取。 　　一次性提取法：将干燥的单粒燕麦种子人工除去种皮后放入单颗种子粉碎机中进行粉碎，制成粗粉，分别加入120μ1体积的提取液，60℃提取40min，离心取上清。 　　分步提取法：种子粉碎同一次性提取法，加入4倍体积的水，60℃水浴提取40min，离心取上清液；用4倍体积的水按同样的方法抽提两次，离心弃上清。在沉淀中加入3倍体积的2．5％NaCi溶液，O℃提取40min，取上清，沉淀加入3倍体积NaCl抽提两次，弃上清；最后加A2倍体积的醇溶蛋白提取液，在同样条件下，提取上清液备用。提取不同贮藏蛋白所需提取液见表2。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1 不同贮藏蛋白电泳图谱结果分析 　　采用分步提取洼对甜燕麦种子4种类型的贮藏蛋白进行提取，经等电聚焦电泳分析，结果表明燕麦种子醇溶蛋白含量最高，电泳谱带最为清晰；水溶蛋白电泳谱带也较为清晰，但含量少，带的数量少；盐溶蛋白电泳后基本没有谱带出现(图1)。 　　一次性提取法对燕麦种子4种类型的贮藏蛋白进行提取，经等电聚焦电泳分析，结果和分步提取洁的效果一致(图2)。 　　燕麦种子贮藏蛋白的两种提取方法进行比较，分步提取法和一次性提取分别对燕麦种子4种贮藏蛋白提取后所得图谱清