同型半胱氨酸对巨噬细胞中Line1 DNA甲基化标准曲线影响.docVIP

同型半胱氨酸对巨噬细胞中Line1 DNA甲基化标准曲线影响 　　摘要：目的寻找简单、可靠、经济准确的检测巨噬细胞中Line-1 甲基化水平的实验方法。方法体外培养单核细胞源性巨噬细胞，不同浓度Hcy作用后以甲基化特异性PCR检测Line-1 DNA甲基化水平变化后，分别克隆扩增相应的片段，将不同浓度稀释的甲基化和非甲基化样品分别加入到荧光PCR体系中，按照荧光PCR体系进行操作，检测其荧光表达，根据相应的稀释倍数与扩增数做出相应的标准曲线。结果各Hcy浓度组的Line-1 DNA甲基化程度随Hcy浓度的增高甲基化程度升高，Line-1 DNA甲基化程度与对照组比较，分别上升了1.30、1.52、1.61、2.18倍，差异有统计学意义(P0.05)；分别得到Line-1 DNA甲基化标准曲线：Y=-4.3448x+51.512；非甲基化标准曲线：Y=-2.7406x+36.208。结论Line-1 DNA甲基化与Hcy介导的动脉粥样硬化关系密切，荧光定量PCR法建立的标准曲线是检测Line-1 DNA甲基化水平的一种方便且准确的方法。 　　关键词：LINE-1；巨噬细胞；同型半胱氨酸；DNA甲基化；荧光定量PCR 　　动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病重要的基础性病变，在AS形成过程中，单核细胞在相关危险因子的作用下转化为巨噬细胞，巨噬细胞细胞的形成是AS主要病理特征之一。同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是AS的独立危险因子[1]，同时有报道指出Hcy可以改变巨噬细胞中保守序列Line-1 DNA甲基化水平从而影响其表达，并由此进一步导致了AS的发生。目前检测甲基化水平的方法很多，但大多属于定性或半定量方法，且在Hcy介导巨噬细胞致AS中Line-1 DNA甲基化水平变化目前人们关注较少，检测方法单一、不准确。本文旨在通过观察Hcy对THP-1单核细胞源性巨噬细胞形成中Line-1 DNA甲基化水平的改变，建立一种新型、高效方便且准确可行的检测DNA甲基化的新方法。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料干粉末RPMI-1640培养基(GIBCO.BKI公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)；Hcy、L-多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、谷氨酰胺、佛波酯(PMA)(Sigma公司)；THP-1单核细胞株(四川大学华西医学院)、DNA甲基化检测试剂盒(赛默公司)、DNA提取试剂盒(promage 公司)。 　　1.2仪器相差显微镜(日本Nikon公司产品)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；全自动立式压力蒸汽灭菌器(上海申安YXQ-LS50A)；微量台式离心机(Eppendorf)；CO2孵箱(Heraeus, Germany)；Model680全自动酶标仪(Bio-rad，America)等。 　　1.3方法 　　1.3.1 THP-1单核细胞的培养、泡沫细胞形成和鉴定取液氮中冻存的THP-1单核细胞株，37℃水浴，完全溶解后加适量RPMI-1640培养基，弃上清，加入PMA使其终浓度为500 mol/l，显微镜下观察，证实THP-1细胞已分化为巨噬细胞，更换含不同浓度的Hcy RPMI-1640培养基培养24h。 　　1.3.2 DNA抽提使用promega DNA提取试剂盒，按说明书进行具体操作。 　　1.3.3 Line-1DNA甲基化水平检测设计甲基化和非甲基化上、下游引物。扩增反应后取产物2μL在2%的琼脂糖凝胶中100V 电泳30min，紫外线照像分析光密度。 　　1.3.4从琼脂糖凝胶中回收DNA①通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中（要尽可能使用长波长紫外光判定DNA片段的位置）。②纯化回收DNA：采用天根生化科技（北京）有限公司的DNA纯化回收试剂盒。按照试剂盒的操作说明书进行。 　　1.3.5 Real-Time PCR建立 LINE- 1DNA甲基化标准曲线①分别将质粒M和质粒U稀释102倍、103倍、104倍、105倍，作为Real-Time PCR 的模板。②反应条件：95℃预变性2min，一个循环；95℃变性30s， 72℃延伸30 s，40个循环。③Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。因此，只要获得位置样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 　　1.4统计学分析采用SPSS 12