南极多环芳烃低温降解菌筛选及其降解特性研究.docVIP

南极多环芳烃低温降解菌筛选及其降解特性研究 　　摘要 从南极嗜冷菌中筛选出1株降解多环芳烃的菌株NJ49，采用16S rRNA分子鉴定方法鉴定其属于希瓦氏菌属（Shewanella）。其降解特性研究表明：它可以在以萘为唯一碳源和能源的无机盐培养基中生长，在5℃低温环境中降解多环芳烃，这可为我国低温养殖海域多环芳烃的清除提供新的途径。 　　关键词 南极低温菌；多环芳烃；筛选；降解特性 　　中图分类号 X172文献标识码A文章编号1007-5739（2008）19-0264-02 　　 　　多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是环境中持久存在的污染物，是重要致癌污染物之一。这种有毒的化学物质遍布于海洋环境，有的被生物体吸收，有的附着在生物体上，有的存在于水体中，因而构成了海洋中的一类特殊的污染物。这类物质可为某些海洋生物所富积或贮存，并经食物链进入人体。我国养殖海域的PAHs污染比较严重，这不仅影响到该海域的生物多样性，也影响到养殖业的发展和水产品的食用安全[1]。 　　研究表明微生物降解是环境中多环芳烃去除最主要的途径[2]。目前，对于我国养殖海域PAHs的微生物降解研究日益增多，但主要集中在常温微生物降解PAHs的研究，对低温微生物降解PAHs研究较少。我国黄海和渤海海域的冬春季水温较低，常温微生物很难清除低温海域的PAHs，因此研究低温微生物对PAHs的降解具有重要意义。本文从南极海洋低温菌中筛选得到1株能降解萘的低温菌NJ49，并对其低温降解特性进行了初步研究，以期为我国低温养殖海域PAHs的清除提供新的技术途径。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1菌株 　　南极细菌菌种是从2002～2003年南极第19次科学考察所采南极海水、海冰和海泥中分离纯化得到的，现存放于国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室。 　　1.2培养基 　　分离纯化培养基为2216E固体：蛋白胨5g；酵母粉1g；用过滤陈海水定容至1 000mL，pH值7.0～7.5，121℃下湿热灭菌20min。 　　筛选培养基为人工海水培养基（MMC）[3]，灭菌后补加适量微量元素混合液；并补以萘作为唯一碳源，萘及微量元素经0.2μm滤膜过滤除菌。 　　1.3生长曲线测定 　　将待测菌株在2216E培养基中，5℃、120rpm低温摇床振荡培养7d。移取5.0mL活化的菌液，用无菌MMC在6 000rpm下离心5min，洗涤2次，取菌体接入装有100mL以萘为唯一碳源的MMC液体培养基中，于5℃、120rpm下振荡培养，每隔24h取样1次，以未接菌的MMC液体培养基做空白，用分光光度计测540nm的吸光值（OD540）。以培养时间为横坐标、OD540为纵坐标绘制生长曲线。 　　1.4萘降解能力的测定 　　移取5.0mL活化的菌液，加入到100mL萘初始浓度为200 mg/L的MMC液体培养基中，在5℃、120rpm上摇床振荡培养10d，每24h取样1次。取出的培养液中加入等体积环己烷，剧烈振荡10min后，萃取萘，用适量环己烷稀释待测萃取液，在275nm处以环己烷为参比测定其吸光度，根据萘-环己烷标准曲线计算萘的质量浓度。 　　1.5菌种鉴定 　　按照CTAB方法提取细菌总DNA[3]，采用细菌16S rDNA的通用引物PCR扩增16S rDNA，构建16S rDNA文库，完成16S rDNA序列测定与系统进化关系的分析。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1南极萘降解低温菌的筛选 　　将385株南极嗜冷菌在以萘为唯一碳源的MMC液体培养基中培养，从中筛选到1株生长旺盛的芳香烃降解菌，编号为NJ49。南极低温菌NJ49能以萘为唯一碳源进行生长，且生长态势良好。 　　2.2南极低温菌NJ49在萘培养基中的生长曲线 　　南极低温菌NJ49在萘培养基中的生长曲线如图1。南极低温菌NJ49在萘培养基中培养11d后达到指数生长期，并逐渐进入稳定期，此时南极低温菌NJ49细胞数量达到最高峰，生长与死亡处于一个动态平衡中。第12天后，由于培养基中的营养基本被消耗，生长速率小于死亡速率，细菌数量开始减少，进入衰亡期。 　　2.3南极低温菌NJ49对萘的降解活性 　　南极低温菌NJ49对萘的降解率如图2。随着时间的推移，南极低温菌NJ49对萘的降解率不断增大。降解前期，降解率缓慢增大，第7天的降解率为17％；在第8天降解率明显提高，为44％；第13天达到最高，为66％。 　　2.4南极萘降解菌NJ49的分子鉴定 　　对南极萘降解菌NJ49的16S rRNA基因序列的相似性进行比较，菌株NJ49序列同Shewanella frigidimarina，Shewanella