吡格列酮通过p―CREB蛋白对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制研究.docVIP

吡格列酮通过p―CREB蛋白对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制研究 　　摘要：目的 通过检测大鼠心肌缺血再灌注p-CREB蛋白表达的变化，探讨吡格列酮对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制。方法 将55只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、吡格列酮组、吡格列酮+GW9662组，左前降支结扎的方法建立缺血再灌注损伤模型，伊文思蓝染色测定心肌梗死面积，Western blot法测定心肌组织p-CREB蛋白表达。结果 吡格列酮组梗死面积与缺血再灌注组比较明显减少（P0.05）；与吡格列酮组相比，吡格列酮+GW9662组p-CREB蛋白表达减少，差异有统计学意义（P0.05）。结论 吡格列酮可能上调p-CREB蛋白表达进而抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤，GW9662可逆转吡格列酮对心肌细胞的保护作用。 　　关键词：缺血-再灌注损伤；吡格列酮；p-CREB蛋白 　　中图分类号：R542.2R256.2 文献标识码：A 　　随着临床上对于急性冠脉综合征的溶栓、介入、冠状动脉搭桥等治疗的广泛应用，使冠心病的治疗进入再灌注时期，冠状动脉再通后都将直接面临心肌缺血再灌注损伤（MIRI）等重大的临床问题。研究发现细胞凋亡在细胞再灌注损伤中发挥重要作用，抗凋亡机制可能是减轻再灌注损伤的新方法。既往发现噻唑烷二酮类药物对缺血再灌注损伤有保护作用，主要是减轻心肌细胞凋亡[1，2]。CREB是环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）应答元件结合蛋白的简称，对细胞的增殖、再生起重要的作用。最初发现CREB与学习及记忆功能有密切关系，近年研究显示p-CREB对循环系统也发挥重要作用[3]。但关于吡格列酮在缺血再灌注时p-CREB蛋白表达的影响报道较少。本实验在原有研究基础上，观察过氧化物酶体增殖物激活受体-r（peroxisome proliferators-activated receptor-r，PPARr）激活剂吡格列酮对大鼠缺血再灌注（I/R）心肌p-CREB蛋白表达的影响，以进一步探讨吡格列酮抗缺血再灌注损伤的分子机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要药品和试剂 盐酸吡格列酮片由日本武田药品工业株式会社生产；GW9662由Pfizer辉瑞公司生产；伊文思蓝由江莱生物公司生产；环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白一抗由Cell Signal公司生产。 　　1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠55只，体重250 g～300 g，山西医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分成4组。假手术组（10只）：生理盐水2 mL/d灌胃；缺血再灌注组（15只）：生理盐水2 mL/d灌胃；吡格列酮组（15只）：吡格列酮10 mg/（kg?d）灌胃；吡格列酮+过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）特异性阻断剂GW9662组（吡格列酮+ GW9662组，15只）：吡格列酮10 mg/（kg?d）灌胃，缺血再灌注前30 min静脉注射GW9662。各组灌胃2周后制作大鼠在体心肌I/R模型。假手术组只开胸穿线，不结扎冠状动脉。 　　1.3 方法 　　1.3.1 模型建立[4] 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠（3 mL/ kg），心电图监测。切开气管进行插管，调整吸呼比1∶2，通气频率60次/min。暴露心脏后在冠状动脉根部1 mm～2 mm处用带6/0线的眼科针穿过肺动脉窦和左心耳之间，垫一塑料管后用止血钳夹紧，观察左室前壁心肌颜色及心电图动态演变。心肌组织颜色变暗或心电图ST段抬高或下降，判断为结扎成功。缺血30 min后放松结扎部位，使冠状动脉再通120 min。再灌完成后剪下心脏，液氮冷冻心室前壁留取的组织，检测心肌梗死面积及提取蛋白质。假手术组只穿线但不结扎冠状动脉，暴露心脏150 min。 　　1.3.2 心肌梗死面积测定[5] 除假手术组外每组各取大鼠5只，再灌注完成后重新结扎先前部位，用2%的伊文思蓝2 mL经腹腔静脉注入，使心脏染色以区分非缺血区（蓝染区） 和缺血区（非蓝染区），迅速取下心脏，剪去心房和右室后无菌纱布吸干表面水分，放入-20 ℃冷藏，沿长轴切成1 mm～2 mm的薄片5张，将切片浸入1%TTC的磷酸缓冲液中（pH值7.4）37 ℃孵育30 min，再用10%的甲醛固定24 h以增强染色颜色对比，照相。心肌组织分为：蓝色为正常心肌，浅红色为缺血未梗死心肌，灰白色为梗死心肌。通过计算机图像分析软件计算梗死心肌占左室面积百分比（IR/LV）。 　　1.3.3 Western blot法测定p-CREB蛋白表达 提取心肌组织匀浆液，用BCA法检测蛋白定量，进行蛋白制样，配制SDS凝胶，然后提取上样量40 g/lane，采用BIO-RAD电泳系统80 V 45 min浓缩，100