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单克隆抗体在黑素瘤诊断中作用 　　恶性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是原发于皮肤的高度恶性肿瘤，是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一，所以早期诊断和及时治疗显得尤为重要[1]。肿瘤标记物可由肿瘤细胞产生或由非肿瘤细胞，如与肿瘤有关的免疫系统产生，可存在于细胞内或细胞表面[2]。因血清肿瘤标记物的检测简便易行，所以在肿瘤学中的应用日益广泛，但在黑色素瘤中大多数血清肿瘤标记物的敏感性和特异性均不高，且大多数在疾病晚期才高表达，因而不适于早期和亚临床期[3]。新的黑素瘤生物标记物的发现及其临床应用价值的研究具有重要意义，可为黑色素细胞瘤建立一种更加准确的具有治疗意义的肿瘤分期和分类方法[4]。 　　1 免疫组织化学在黑素瘤诊断中的作用 　　1.1 黑素瘤诊断中存在的问题及解决方案：尽管大多数黑素瘤通过临床表现、组织病理检查即可诊断，但仍然有部分的原发黑素瘤和转移性恶性黑素瘤难以诊断及识别其组织来源，需要借助免疫组织化学帮助诊断。抗黑素瘤相关抗原单克隆抗体因此成为辅助诊断恶性黑素瘤的有力工具，即便是以无色素性黑素瘤为表型的黑素瘤也不例外。 　　1.2 抗黑素瘤相关抗原抗体在诊断黑素瘤中的作用：S-100蛋白（S100 proteins，S-100）是一种钙结合蛋白，抗S-100蛋白抗体对黑素细胞和黑素瘤染色灵敏性高，但特异性不高，人类黑色素瘤-45（Human Melanoma Black-45，HMB-45）识别黑素小体特异性糖蛋白GP100对黑素细胞有很高的特异性[5]。但其应用受染色异质性和灵敏性较S-100差的限制，且假阴性率高达35%，黑素A（MelanA）/ 黑素瘤抗原-1（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART-1）和酪氨酸酶（Tyrosinase）在转移性黑素瘤中也有10%～15%不表达相反，敏感的标记物小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），存在许多亚型并在其他组织中表达，因此，阳性结果不一定反映黑素瘤。故此，不能单独应用某一种抗体诊断黑素瘤。所以，到目前为止还没有在灵敏性和特异性上都令人满意的抗体[6-7]。 　　2 PNL2的基本性质 　　2.1 PNL2的性质：Rochaix等[8]于2003年首次提出PNL2可作为黑素瘤细胞标志物。接着Kurotaki等[9-10]证实PNL2蛋白对人类和白化鼠黑素瘤具有诊断价值，可PNL2蛋白的基因组研究、确切作用机制及过程尚未发现。 　　2.2 PNL2单克隆抗体的制备：Rochaix等[8]指出PNL2单克隆抗体的制备，是在BALB/C（人源化小鼠的代号）小鼠腹膜内注射耦合类人生长抑素受体2与谷胱甘肽S-转移酶C末端部分的重组蛋白后，经过一段时间免疫克隆产生的抗体。非免疫球蛋白产生的骨髓瘤细胞系P3×63 Ag8-653也作为配偶体，经过标准技术参与PNL2单克隆抗体的产生。并通过人胰腺和扁桃体的冰冻切片的ELISA活性和间接免疫过氧化物酶方法的聚链反应测试出上清液中的抗体。最后根据制造商的协议使用同系小鼠单克隆抗体分型试剂盒进行同种型抗体鉴定。 　　3 PNL2在黑素瘤诊断中的作用 　　3.1 不同物种的PNL2蛋白与黑素瘤的关系：Kurotaki等[9]研究表明，PNL2可作为诊断人类、小鼠和白化鼠黑素瘤的标志物，得出PNL2是最近产生的单克隆抗体（mAb）识别正常和肿瘤黑素细胞，但PNL2识别的抗原目前仍未发现。Giudice等[11]首次采用PNL2来检测犬黑素细胞抗原。通过对PNL2在犬黑素瘤免疫反应进行测试（4例犬的原发性黑素瘤，2例为口腔黑素瘤，2例为甲床黑素瘤），并与Melan A进行比较。并采用正常的犬组织和非黑素瘤作为阴性对照，对犬黑素瘤的冷冻样品进行福尔马林固定、石蜡包埋后通过Western blot分析黑素细胞与PNL2和Melan A免疫反应性。Western blot检测证实犬黑素瘤中PNL2抗体蛋白的存在。PNL2免疫组化染色的犬黑素瘤细胞胞浆内出现颗粒状花纹。在所测试的黑素细胞肿瘤，PNL2阳性率为62.0%，Melan A为59.0%；两种单克隆抗体染色皆阳性50.7%。这两种抗体染色至少有一种抗体阳性的例数占68.0%。使用PNL2染色显色范围比Melan A更大。类似人类粒细胞，犬粒细胞的黑素瘤的PNL2染色分别采用Western blot和免疫组化分析均为阴性。可见，PNL2单抗在福尔马林固定的犬黑素细胞肿瘤的识别中仍然是一个有价值的诊断试剂。犬和人类黑素瘤中提取物与PNL2的免疫染色显示类似的结果，这表明人和犬这两个不同的物种的黑素细胞中存在能与PNL