原花青素对大肠癌HT―29细胞增殖及Pim―1Bcl―2CyclinD1基因影响研究.docVIP

原花青素对大肠癌HT―29细胞增殖及Pim―1Bcl―2CyclinD1基因影响研究 　　【摘要】目的探讨原花青素对大肠癌HT29细胞增殖及Pim1、Bcl2、CyclinD1基因的影响。方法取对数生长期HT29细胞，分别加入100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L原花青素培养，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖；采用荧光定量PCR检测Pim1、Bcl2、CyclinD1 mRNA表达。结果24 h时，各浓度组原花青素对HT29细胞增殖抑制率分别为 （428±034）%、（1005±061）%、（1667±063）%、（2816±091）%；48 h时，各浓度组原花青素对HT29细胞增殖抑制率分别为（1147±153）%、（1765±121）%、（3082±199）%、（4448±218）%，对Pim1、Bcl2、CyclinD1 mRNA表达有抑制作用（P 005），且作用呈浓度依赖性。结论原花青素体外可呈浓度依赖性抑制HT29细胞增殖，其机制可能与抑制Pim1、Bcl2、CyclinD1表达有关。 　　【关键词】原花青素；大肠癌；HT29细胞株；细胞增殖 　　作者单位：524001广东医学院附属医院消化内科（魏国丽周宇），中医科（郑学宝刘强）原花青素（procyanidin，PA）是一种有特殊分子结构的多酚化合物，葡萄籽内含量最高，具有快速清除水溶性、脂溶性自由基、抗辐射、抗过敏、改善循环、延缓衰老、增强免疫力等功效。研究显示，PA对乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤均有显著抑制作用[1]。本研究旨在探讨PA对大肠癌HT29细胞增殖及Pim1、Bcl2、CyclinD1基因的影响，以期为PA用于治疗结肠癌治疗提供初步实验及理论依据。 　　1材料与方法 　　11实验材料药物和细胞株 　　PA（纯度95%，陕西方晟科技有限公司）；人大肠癌HT29细胞株（中南大学湘雅中心实验室）。四甲基偶氮唑蓝（MTT）（武汉博士德生物工程有限公司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物制品公司）；胰蛋白酶（trypsin）（美国Amresco公司）；二甲亚砜（DMSO）（德国WAK公司）；荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物技术有限公司）；PCR引物由上海生物工程公司合成。ABI PRISM 7500 Sequence Detection System （SYBR Green PCR Master Mix，TOYOBO 公司）。 　　12实验方法 　　121细胞传代培养将人结肠癌HT29细胞置于含10%新生胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中传代培养， 取对数生长期细胞用于实验。 　　122细胞增殖活性检测采用MTT法，调整细胞密度为1×104/ml 接种于96孔板上，200 μL/孔。待细胞贴壁后，实验组加入不同浓度PA（100、200、400、800 mg/L），对照组加无血清的RPMI 1640培养液（不含PA）。作用24 h、48 h后弃上清，加入无血清的RPMI1640培养液180 μL，同时加入5 mg/ml MTT 20 μL，37℃继续培养4 h。弃孔内上清液后，加入DMSO 150 μL 振荡10 min，使结晶充分溶解；490nm波长下，检测吸光值（A490），记录结果。计算公式：细胞增殖抑制率=（对照组吸光值实验组吸光值）/对照组吸光值×100%。 　　3讨论 　　原花青素是来源于多种植物的一大类酚类化合物，有广泛抗肿瘤活性。葡萄籽原花青素可抑制人乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌等细胞株的细胞增殖，并诱导凋亡，其作用机制与Bcl2家族有关[1]。有研究发现，PA对大肠癌细胞HT29、SW480 与 LoVo的增殖抑制呈浓度依赖关系[2，3]。本研究取对数生长期HT29细胞分别加入100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L的PA培养，发现HT29细胞的增殖呈时间依赖性及浓度依赖性，随着PA浓度增加和作用时间延长，HT29细胞增殖的抑制率明显增高，与上述研究的结果一致，说明PA对HT29的增殖有抑制作用。 　　细胞过度增殖与肿瘤发生密切相关，Pim1、Bcl2、CyclinD1在调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥了重要作用，其表达异常与结肠癌等各种恶性肿瘤的发生有密切关系。Pim1是丝/苏氨酸激酶Pim家族的第一位成员，其过度表达可阻断多种凋亡诱导通路、干扰细胞周期的正常调控，导致结肠癌细胞过度增殖[4]。Bcl2是凋亡抑制基因，其功能是通过阻断程序性凋亡过程促进结肠癌细胞增殖、生长[5，6]。研究表明Pim1诱导细胞凋亡的机制之一是直接磷酸化Bcl2家族促凋