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响应面法优化鸡血藤悬浮细胞产异黄酮研究 　　摘要：分别通过单因素试验和Box-Behnken中心组合试验来优化鸡血藤悬浮细胞产异黄酮的培养基组成和培养条件。响应面法分析指出最佳工艺条件为蔗糖39.3 g/L，水解酪蛋白3.95 g/L，培养温度22.7 ℃。在此优选工艺下，鸡血藤悬浮细胞干质量和总异黄酮含量平均值分别为11.65 g/L和5.34 mg/L。总异黄酮含量与预测值5.41 mg/L相差比例仅为2.65%，说明该模型准确有效。响应面法优化大幅度地提高了鸡血藤悬浮细胞产异黄酮含量，为鸡血藤异黄酮的深入开发提供了技术基础。 　　关键词：鸡血藤；悬浮细胞；异黄酮；Box-Behnken中心组合试验；响应面 　　中图分类号：R284.2 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0050-03 　　鸡血藤是豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤茎，主产广西，广东、云南也有分布。鸡血藤是补血、活血的传统大宗中药材，具有促进造血功能、抗炎、抗氧化、免疫调节、镇静催眠等药理作用[1]。此外，现代医学研究还发现鸡血藤具有广谱的抗肿瘤和抗病毒活性[2-3]。药理学研究表明，鸡血藤药理作用的关键活性成分是异黄酮类化合物，主要包括大豆黄酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂异黄酮这4种主要的异黄酮活性成分[1，4]。中药材植物细胞的悬浮培养可以生产异黄酮，如怀槐[5]、野葛[6]、大豆[7]等，但目前尚未有关于鸡血藤悬浮细胞产异黄酮的报道。近年来，鸡血藤野生资源面临枯竭，供需矛盾尖锐，因此开展悬浮细胞产鸡血藤活性成分的研究具有重要意义。本研究采用响应面法优化鸡血藤悬浮细胞的培养基成分，提高异黄酮活性成分的产量，为对鸡血藤药效的深入开发提供基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验材料为鸡血藤愈伤组织，取自鸡血藤嫩叶部位，通过添加1.0 mg/L 6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、0.5 mg/L NAA（α-萘乙酸）、30 g/L蔗糖、0.1 g/L 维生素C以MS培养基诱导愈伤组织[8]。愈伤组织在（25±1） ℃、暗环境下培养，每15 d继代1次。愈伤组织经过传代筛选获得浅黄色、疏松颗粒状的愈伤组织培养系，准备接种。 　　1.2 细胞悬浮培养条件 　　将上述愈伤组织（约为5 g鲜质量/瓶）接入液体MS培养基，其中添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、0.1 g/L、3 g/L水解酪蛋白。细胞置于含100 mL培养基的300 mL 三角烧瓶中进行培养，于（25±1） ℃暗环境下以 100 r/min 的速度摇瓶悬浮培养12 d，每组试验设置3个重复。 　　1.3 试验设计 　　1.3.1 单因素试验设计 在单因素试验设计中，在初始培养基（碳源：蔗糖30 g/L；氮源：水解酪蛋白3 g/L；培养温度 25 ℃）的基础上分别对碳源种类和浓度、氮源浓度和培养温度进行优化。试验依次进行，后续试验均应用前面试验得出的最优结果。 　　碳源：使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉作为单独碳源，维持起始浓度均为30 g/L，考察不同来源碳源对发酵后细胞干质量及总异黄酮合成量的影响。在此基础上采用蔗糖为基础碳源，测试10、20、30、40、50、60 g/L起始条件下对发酵后干细胞总质量与总异黄酮合成量的影响。 　　氮源：调节MS培养基中的水解酪蛋白浓度分别为0.5、1、2、3、4、5 g/L，经过12 d封瓶批次发酵后测量总细胞干质量以及总异黄酮的合成量。 　　培养温度：分别采用10、15、20、25、30、35 ℃条件培养鸡血藤悬浮细胞，考察最终发酵细胞总干质量及总异黄酮的合成量变化。 　　1.3.2 Box-Behnken中心组合试验设计 在单因素试验的基础上，对蔗糖、水解酪蛋白、培养温度进行Box-Behnken中心组合试验设计。 　　1.4 细胞生长和异黄酮含量测定 　　发酵12 d后，收集鸡血藤细胞培养物，60 ℃下干燥至恒质量，细胞生物量为1 L培养基收获的细胞干质量（g/L）。将细胞充分研磨后于95%乙醇冷浸24 h，超声波处理 30 min，过滤。提取3次，合并滤液，40 ℃下减压浓缩，100 mL乙酸乙酯 ∶水（体积比5 ∶1）混合溶液萃取3次。而细胞过滤发酵液经低温冷冻浓缩后直接通过乙酸乙酯萃取抽提。 　　合并乙酸乙酯抽提液，于40 ℃下减压蒸馏。甲醇溶解定容至5 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后HPLC定量分析。色谱条件：Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱：Purospher Star C18柱（4.6 mm i.d.×250 mm，5 μm），流动相为甲醇