国外引进双孢菇菌种与国内栽培菌种RAPD和酯酶同工酶指纹图谱分析.docVIP

国外引进双孢菇菌种与国内栽培菌种RAPD和酯酶同工酶指纹图谱分析 　　摘要：利用RAPD和酯酶同工酶指纹图谱对国内主栽的2个双孢菇菌株及从荷兰、美国引进的8个双孢菇菌株进行亲缘关系分析。结果表明，从47个RAPD引物中筛选了14个条带清晰重复性好的引物，共产生了88条清晰的扩增条带，其中多态性条带64条，多态性位点百分率为72.73%，10个菌株可分为4个类群；酯酶同工酶电泳共扩增出了清晰条带7条，其中多态性条带6条，多态性位点百分率为85.8%，10个菌株可分为3个类群。2种技术均显示，国内菌株与国外引进菌株之间亲缘关系较远。因此，引进国外优质双孢菇菌株对增加中国双孢菇遗传多样性具有重要作用。 　　关键词：双孢菇；酯酶同工酶；RAPD；亲缘关系 　　中图分类号： S646.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0254-03 　　双孢菇（Agaricus bisporus）是中国广泛栽培的一种中低温性食用菌，近年来产量不断增加。但是，中国的双孢蘑菇品种之间遗传关系较近[1]，且缺乏系统的归类整理，导致中国目前市场上菌种的同种品种不同名称，或者是不同品种同一名称的混杂现状，直接影响了中国双孢菇菌种的生产、种质资源的保护和优良菌种选育。采用合理有效技术对双孢蘑菇进行品种划分，区分其品种亲缘关系，鉴定双孢蘑菇的品系显得尤为重要。 　　RAPD技术是Williams研究小组提出的一种分子标记技术[2-3]。该技术通过人工合成的核酸单链（常为10个碱基）为引物，以试验对象的DNA为模版，进行PCR扩增，产生一系列不同分子量的基因片段，不同引物的凝胶电泳结果，可以作为品系的遗传特征进行记录，用于品种鉴定。RAPD技术设备简单，技术简便易行，目前，已广泛应用于不同物种的遗传多样性研究[4-9]。同工酶分子标记是从基因产物水平来研究生物的遗传变异，是一种重要的分子遗传标记技术[10]，酶带的变化可作为鉴定物种，研究分类、进化、遗传与变异的重要指标。自1959年Markert等提出酯酶同工酶概念后，酯酶同工酶标记技术在许多食用菌研究中得到了广泛的重视和应用[11-14]。高分辨率的同工酶技术成为生化分类的主要方法之一[15]。 　　本研究利用RAPD和酯酶同工酶技术对中国的2个主栽双孢菇菌株及从荷兰、美国引进的8个优质双孢菇菌株进行遗传相似性分析，从分子水平上研究双孢菇菌株之间的亲缘关系和遗传差异，为双孢菇菌株的鉴定提供技术支持，同时为双孢菇种质资源的引进及引进菌株在双孢菇遗传育种方面的应用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌种 （1）258、2796本实验室保藏；（2）H901、HRLM、F3F、HA15引自荷兰；（3）L901、5113、XXX、2200引自美国。 　　1.1.2 PCR试剂 RAPD引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA marker、Gelstain等购自北京全式金生物技术有限公司。 　　1.1.3 仪器设备 JY300C电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司生产；蓝盾580可见光凝胶电泳透射仪：厦门致善生物科技有限公司生产；A200PCR仪：杭州朗基科学仪器有限公司生产；04S-3C全自动数码凝胶图像分析系统：北京君意东方电泳设备有限公司生产；3K30冷冻高速离心机：德国Sigma公司生产。 　　1.2 方法 　　1.2.1 RAPD分析 双孢菇菌株利用PDA液体培养基[16]，24 ℃ 150 r/min 培养14 d，过滤收集菌丝体。菌丝体DNA提取采用CTAB法[17]。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计检测 DNA浓度，稀释至10 ng/μL，于-20 ℃冰箱中保存备用。PCR反应体系为15 μL，含1×PCR缓冲液、DNA模板 20 ng，dNTPs 200 mmol/L，引物0.3 μmol/L，TaqDNA聚合酶 1 U。PCR反应条件为：94 ℃预变性7 min；94 ℃变性1 min，退火1 min（退火温度视引物而定），72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃终止反应。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压4 V/cm，Gelstain染色，凝胶成像系统观察并照相。 　　1.2.2 酯酶同工酶分析 称取0.5 g菌丝体，置于预冷的灭菌研钵中，加1 mL 样品提取液，加少量灭菌石英砂，冰浴研磨，收集于1.5 mL离心管中。4 ℃ 10 000 r/min 离心5 min，将上清液、蔗糖溶液、溴酚蓝溶液按5 ∶1 ∶1的比例混合，即为电泳样品[18]。电泳分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为48%，电极缓冲液采用Tr