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基于产品质量分析中国仓鼠卵巢细胞流加培养工艺优化 　　摘要：在前期建立的流加培养工艺的基础上，考察培养过程中的pH值对流加培养过程的影响，明确了过程控制参数pH值与产品关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）间的联系，建立了产物质量属性和过程操作属性间的关系，并确认pH值为抗体融合蛋白生产工艺中的关键控制参数。结果表明，流加培养过程随着培养pH值的提高，抗体融合蛋白的生物学活性呈一定程度的下降趋势，但唾液酸含量却呈明显的上升趋势;此外，在pH值6.9和pH值7.0的条件下培养过程中的最大细胞密度、活力、蛋白表达量均优于其他条件，确定6.95±0.05为过程的控制pH值。将此培养工艺放到大200 L中试生产规模，结果与2 L反应器的结果基本一致。 　　关键词：CHO细胞;pH值;抗体融合蛋白;流加培养;产品质量 　　中图分类号： Q813.1+1 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）04-0047-03 　　收稿日期：2014-12-21 　　基金项目：国家自然科学基金（编号。 　　作者简介：刘金涛（1987―），男，山东临沂人，博士研究生，主要从事动物细胞大规模培养研究。E-mail：jtliu0416@。 　　通信作者：谭文松，教授，博士生导师，主要从事动物细胞大规模培养研究。E-mail：wstan@。 　　抗体药物由于具有靶点明确、临床疗效显著、副作用少等优点已成为当今生物医药产业发展的主流，其中动物细胞大规模培养技术是生产抗体药物最主要的技术手段。“质量可控，安全有效”是药品研发过程中应首要遵循的原则，美国FDA在21世纪现行优良生产规范（current good manufacturing practices，cGMPs）中提出的一个关键要素就是质量源于设计（quality by design，QbD）[1]。因此在工艺开发中始终贯彻QbD原理，设计不同的参数控制范围来设计产品的质量，使得产品质量始终处于可控状态，对加快药品开发有着十分重要的意义[2]。 　　前期我们关于培养温度对细胞生长和产物表达影响及机制进行了深入的研究和探讨[3-4]，而培养过程中的另一关键控制参数――pH值对细胞生长和表达有着重要作用[5]。一方面由于pH值在摇瓶、孔板等小规模培养高通量系统中难以进行有效的检测和控制，导致在放大到反应器规模时则会出现产品质量不可控制的状态;另一方面细胞在培养过程中乳酸等代谢副产物的大量生成导致培养体系中的pH值发生较大变化，须要通过补酸或补碱的方式维持pH值的稳定。因此在反应器中系统研究pH值对于细胞生理状态特别是产物质量的影响是保证生产过程中产品质量可控的一项必不可少的工作。 　　本研究以表达抗体的融合蛋白的重组中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞为研究对象，以抗体融合蛋白关键质量参数为主要评价标准，同时结合细胞生长、代谢和产物表达情况，在2 L生物反应器中对流加培养过程中的操作参数pH值进行了详细的考察，通过综合分析确定最适pH值，并成功地将该工艺稳定地放大到中试生产规模。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株和培养基 　　试验细胞株为表达抗体融合蛋白的重组CHO细胞。基础培养基为商业Excell 302培养基（SAFC），流加培养基为笔者实验室自主开发[6]。培养基经0.22 μm微孔滤膜（millipore）过滤除菌，保存于4 ℃冰箱。培养基配制所用试剂均购自Sigma-Aldrich公司。 　　1.2 细胞培养 　　从细胞库中复苏重组CHO细胞，以（2～3）×105 个/mL活细胞密度接种于摇瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，转速为120 r/min，作为试验用的种子细胞。取对数生长期的CHO细胞，以约1.0×106 个/mL的活细胞密度接种至反应器中，培养体积为1.5 L。培养过程中每24 h取样，计数。培养液经10 000 r/min离心10 min后取上清于-20 ℃保存，用于试验结束后营养物、代谢副产物、抗体融合蛋白的检测。培养过程均使用Sartorius公司生产的2 L BIOSTAT A-plus 细胞反应器。培养时反应器操作条件：溶解氧为50%，温度为 37 ℃，搅拌转速为150 r/min，pH值分别控制在6.8、6.9、70、7.2条件下（无控制作用区设为±0.02）。pH值的控制采用深层通入CO2或者补入1 mol/L NaOH 溶液的方式。流加策略采用葡萄糖控制模型[6]。 　　1.3 分析方法 　　细胞密度和活力采用Bio-Rad TC20TM 自动计数仪，葡萄糖、乳酸、氨的检测采用 NOVA Biopr