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流式细胞仪及其在医学研究中的应用 　　【摘要】 流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术，常用来做细胞分析和细胞分选，在医学基础研究、临床诊断和检测中具有广泛的应用前景。本文以BD公司推出的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪为例，分别从仪器的基本结构、工作原理、主要参数及数据处理、医学研究及应用、注意事项及日常保养这几个方面系统阐述流式细胞仪的使用。 　　【关键词】 流式细胞仪； 分选； 医学研究； BD FACSAria Ⅱ 　　中图分类号 R197.39 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2016）22-0160-03 　　doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.22.086 　　流式细胞分析技术（Flow Cytometry，FCM）简称流式细胞术，是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术，常用来做细胞分析和细胞分选，广泛应用于医学基础研究、临床诊断以及疾病的监测等[1]。全球最早的一台流式细胞仪是在1973年由美国BD公司推出[2]，近年来，随着科技的发展创新和医学的进步，流式细胞仪的性能不断完善，操作日渐灵活，成为目前临床医学研究中不可或缺的检验工具。本文以BD公司推出的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪为例，分别从仪器的基本结构、工作原理、主要参数及数据处理、医学研究及应用、注意事项及日常保养这几个方面系统阐述流式细胞仪的使用。 　　1 基本结构 　　流式细胞仪的基本结构主要包括四部分：流动室及液流系统、激光源及光学系统、光电管及检测系统、计算机及分析系统[3-5]。流动室是流式细胞仪的核心，主要部件有样品管、鞘液管和喷嘴。本实验室的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪配有四中不同尺寸的喷嘴（70、85、100、130 ?m），以满足不同微粒的需要。FCM的光源选择主要依据所用染料的激发光谱而定，本实验室的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪配有三种波长的激发光（355、488、633 nm），最多可以检测9个荧光通道。 　　由一定波长的激发光激发出来的荧光信号需要经过光电倍增管（PMT）接收后转变为电信号，再经过放大器放大后才能被计算机检测。流式细胞仪一般配有两类放大器，一种是线性放大器，用于DNA测量；另一种是对数放大器，用于免疫学分析。BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪的很多功能及其数据分析都是由BD FACSDiva TM软件及其工作站来实现的。 　　2 工作原理 　　流式细胞仪主要用作细胞分析和细胞分选，将待测样品制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后装入样品管，由系统产生一定气体压力将样品管送入流动室，细胞悬液从样品管射出，样品管周围由鞘液包围，鞘液管与样品管成一定角度使得待测细胞在鞘液的作用下成单行排列，形成细胞柱，通过喷嘴与入射的激光束垂直相交，细胞或颗粒被激光激发产生荧光信号和非荧光散射信号，最终通过光学系统和检测系统处理后由计算机输出。由于各细胞或颗粒的大小、内部结构、理化性质、蛋白质含量、核酸（DNA或RNA）含量等的不同，使得接收到的荧光信号和非荧光散射信号也不同，从而实现对不同性质的细胞或群体进行分析和分类[6]。BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪的工作原理示意图如图1所示。 　　流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。在分选过程中，仪器通过高频振荡对液流施加液滴驱动能量，使其断离为均匀的液滴，根据事先确定的分选标准由系统判断是否将被分选，由充电电路对选定的细胞液滴进行充电，当带电液滴通过电场时，会在电场的作用下向左或向右偏转，具体方向取决于液滴的电荷极性，未带电荷的液滴不受电场的影响，它们将在中心位置通过，最后进入废液抽吸器，发生偏转的液滴落入相应的收集器中，从而实现细胞分选[7]。一般来说，在进行较大或者脆弱细胞的分选时，为了得到最佳结果，应该使用较大的喷嘴和较低的压力；在分选较小或者非脆弱细胞时，如果要增加产量，应该使用较小的喷嘴和较高的压力。张立霞等[8]整理了应用FCM进行分选时遇到的问题及解决方案。 　　3 主要参数及数据处理 　　3.1 主要参数 　　流式细胞仪的检测信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号[9]。特异性荧光信号主要包括两部分：（1）自发荧光，即不经荧光染色，细胞内部的荧光分子自发产生的荧光；（2）特征荧光，即细胞经荧光染料染色后发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨。在实验中，为了减少自发荧光干扰，提高信噪比，常采用以下措施：①选用适宜的激光和滤片；②选用较亮的荧光染料；③采用荧光补偿，将自发荧光的本底贡献予以补偿。非荧光散射信号分为前向角散射（Forward Scatter，FSC）和侧向角散射（Side Scatter，SSC）。