基于多肽微阵列芯片荧光和共振光散射法筛选凝血酶抑制剂.docVIP

基于多肽微阵列芯片荧光和共振光散射法筛选凝血酶抑制剂 　　摘 要 研制了一种基于多肽微阵列芯片的荧光和共振光散射双通路检测方法，对血液样品中的凝血酶抑制剂进行检测。以生物素化的多肽微阵列芯片为反应平台，加入凝血酶水解多肽上的特异位点使其C末端的生物素解离，通过亲和素和生物素之间的特异性结合， 用荧光探针和30 nm金纳米粒子探针标记此反应过程。凝血酶抑制剂阻止凝血酶对底物多肽的水解反应，通过荧光和共振光散射信号强度的变化检测抑制剂的抑制能力。酶溶液和加标人血清中测定的半抑制浓度（IC50）值：阿加曲班抗凝血酶Ⅲ胰蛋白酶抑制剂N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐。在血浆中考察了阿加曲班和抗凝血酶Ⅲ的可逆性。对比荧光法和共振光散射法在血液样品中的检测结果，用30 nm金纳米粒子标记的共振光散射法更适用于复杂血液样品中抑制剂的检测 　　关键词 多肽微阵列； 金纳米粒子探针； 共振光散射； 半抑制浓度； 凝血酶抑制剂 　　1 引 言 　　蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，凝血酶是一种重要的蛋白酶，主要参与血液凝结级联反应，使血液凝结成块阻止血液流失【1】。凝血酶与血栓栓塞性疾病的诊断和治疗密切相关【2】，以凝血酶为靶点的抗凝血药物是临床用于治疗血栓的主要药物【3】，开发高效、价格低廉的抗凝血药物是目前药物学研究热点【4，5】。 　　微阵列生物芯片技术可以在一张芯片上集成多种生物化学反应，能够实现对生物活性物质高效快速地测试和分析【6，7】。固定蛋白酶或蛋白酶特异底物的微阵列芯片可以同时分析多种抑制剂与蛋白酶之间的作用机理和作用效率【8，9】。Uttamchandani等用蛋白微阵列芯片同时检测了3种化合物对4种半胱氨酸蛋白酶的抑制效率【10】； Neumann等用小分子微阵列芯片从近10万个有机小分子中筛选出了6种能与凝血酶活性位点结合的化合物【11】。迄今为止，仍鲜有使用多肽微阵列芯片在血液样品中筛选凝血酶抑制剂的报道。 　　本研究利用多肽微阵列芯片反应平台，荧光（Fluorescence）和共振光散射（Resonance Light Scattering，RLS）双检测手段，在血液样品中检测凝血酶抑制剂的抑制效率。双通路检测手段提高了检测结果的准确性，在加标血清和血浆中检测并比较了5种化合物对凝血酶的抑制能力，并研究了在血浆中两种抑制剂对凝血酶抑制作用的可逆性。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　晶芯SmartArrayerTM136微阵列芯片点样系统和晶芯LuxScan10K微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物技术有限公司）；PMC082芯片离心机（美国ChipMate公司）；SpotWareTM芯片扫描系统（美国Arrayit公司）。 　　人血液样品从长春市中心血站暨吉林省血液中心获得；荧光素标记的亲和素（FITC-Avidin）、凝血酶（Thrombin）、阿加曲班（Argatroban）、4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）、胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor）和N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E-64）（美国Sigma-Aldrich公司）；光学级三维高分子D基片（北京博奥生物有限公司）；多肽：CALNN， CALNNGK（biotin）G和CAEGGfPRSFRVVK（biotin）（上海强耀生物科技有限公司）；抗凝血酶Ⅲ（Human Antithrombin-Ⅲ，HAT-Ⅲ，美国HTI公司）；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 MΩ cm）。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 血液样品制备 血液采集后6 h内离心分离血浆，并速冻制成新鲜冰冻血浆， 　　保存。 　　用血浆稀释缓冲液（pH 7.35， 20 mmol/L HEPES，21.7 mmol/L柠檬酸钠，60 g/L BSA）将40 μL血浆稀释1倍，加入20 μL的激活剂（30 pmol/L 重组人组织因子和24 μmol/L磷脂混合物（磷脂酰丝氨酸∶磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰胆碱=1∶1∶3，摩尔比），37 　　孵育5 min。加入20 μL HEPES缓冲液（pH 7.35， 20 mmol/L HEPES，60 g/L BSA，0.1 mol/L CaCl2），制成活化的血浆。 　　将活化血浆1300 g离心10 min，分离得到血清。 　　2.2.2 金纳米粒子探针制备 　　100 mL超纯水中加入2 mL 1% 氯金酸溶液，加热至沸；加入2 mL 2%柠檬酸钠溶液继续加热搅拌30 min，合成30 nm粒径的金纳米粒子【12，13】。取120 μL 1 g/L CALNN