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基于对荧光铜纳米簇合成抑制检测三聚氰胺 　　摘 要 三聚氰胺能与铜离子（Cu2+）形成配合物，对荧光铜纳米簇的合成有明显抑制作用，且其抑制程度与三聚氰胺浓度在一定范围内呈线性关系。基于此构建了一种简单、快速检测三聚氰胺的方法。以聚T单链DNA为模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，当三聚氰胺存在时，Cu2+与三聚氰胺生成配合物，阻碍铜纳米簇的合成，导致荧光强度降低。在优化的实验条件下，三聚氰胺浓度在5～120 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为1.5 μmol/L，牛奶样品中三聚氰胺加标回收率为96.3%～104.4%。与传统纳米金/银、量子点等方法相比，本方法具有简单、快速、灵敏等优点。 　　关键词 铜纳米簇； 铜-三聚氰胺配合物； 荧光； 非标记 　　1 引 言 　　三聚氰胺是一种低毒性的氮杂环有机化工原料，常用于制造三聚氰胺树脂，是建筑业常用的防火材料。由于其分子中含氮量为66%，且无味，掺杂后不易被发现，一些不良企业为降低成本，在乳制品和饲料中添加三聚氰胺，以提高食品检测中蛋白质含量指标。然而，三聚氰胺会与尿酸结合生成难溶于水的结石[1]，导致肾积水、肾结石等肾脏膀胱疾病，甚至死亡。因此，发展快速、准确、灵敏的三聚氰胺的测定方法对保障乳制品安全具有重要的实际意义。 　　传统的三聚氰胺检测方法包括高效液相色谱法[2]、气相色谱-质谱联用法[3]、电位滴定法[4]、酶联免疫吸附分析法[5]等，上述方法一般需要专业的操作人员，且存在选择性低或者精确度不高的不足，难以满足实际食品监管中快速、高效、低成本的检测要求。近年发展的新方法， 如纳米材料比色法[6～8]、荧光探针法[9]、分子印迹聚合物法[10]和表面增强拉曼散射技术[11，12]等，与传统方法相比，具有检出限低、灵敏度高的优势，但是预处理过程繁琐耗时，需要衍生或者昂贵的仪器。 　　最近，Qing等[13]发现，富含胸腺嘧啶T的单链DNA可作为合成铜纳米簇的有效模板。聚T为模板合成的铜纳米簇荧光强度高，而且尺寸和荧光强度可以通过聚T单链DNA的长度来调节；此外，基于聚T单链DNA 的铜纳米簇的合成在几分钟内即可完成，比其它金属纳米簇的合成快速、简捷。如随机dsDNA-铜纳米簇合成中，为了保证双链DNA模板的有效杂交，耗时需1 h以上[14]；DNA-银纳米簇的合成需要在黑暗中反应24 h[15]；BSA-金纳米簇的合成需要2 d[16]。 　　三聚氰胺可以通过芳香环上的氮原子与Cu2+形成配合物[17]。基于此，本研究提出了一种检测三聚氰胺的方法。利用聚T单链DNA为模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，由于三聚氰胺与Cu2+发生配位反应，阻碍了铜纳米簇的合成，导致铜纳米簇荧光信号减弱。此方法用于三聚氰胺的检测快速、操作简单、成本低，并成功用于实际牛奶样品中三聚氰胺的检测，在食品安全监管等方面具有良好的应用前景。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　含30个碱基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸链（T30）由上海生工生物工程公司合成。3-（N-吗啉基）-丙磺酸（MOPs）、抗坏血酸、CuSO4?5H2O、NaCl 和三聚氰胺（北京鼎国生物技术公司）；其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（18.25 MΩ?cm）。 　　Cary Eclipse荧光分光光度计（美国安捷伦公司），激发波长340 nm，扫描范围500～660 nm，激发狭缝设定为5.0 nm，发射狭缝设定为10.0 nm。 　　2.2 荧光铜纳米簇的制备 　　T30DNA为模板的铜纳米簇的制备参照文献[13]的方法稍作修改，简述如下：将5 μmol/L T30-DNA、MOPs缓冲液（10 mmol/L MOPs，150 mmol/L NaCl，pH 7.6）、3 mmol/L抗坏血酸溶液混合均匀后，加入300 μmol/L CuSO4溶液，避光反应1 min，得到荧光铜纳米簇。 　　2.3 三聚氰胺的检测 　　将300 μmol/L CuSO4溶液与不同浓度的三聚氰胺溶液混匀，室温下孵育20 min。反应后的溶液加入到含有5 μmol/L T30-DNA、MOPs缓冲液、3 mmol/L抗坏血酸溶液的体系中，室温下避光反应1 min，立即进行荧光检测。 　　3 结果与讨论 　　3.1 实验原理 　　三聚氰胺可以通过芳香环上的N与Cu2+形成配合物[17]，基于此，本研究构建了检测三聚氰胺的策略，如图1所示。以含30个碱基的聚胸腺嘧啶的单链DNA为模板，以抗坏血酸为还原剂， Cu2+被还原为Cu0，并富集在T30单链DNA上，生成具有强荧光的铜纳米簇，并作为信号报告探针（图1A）。当三聚氰胺存在时，与Cu2+发生配位反应，不利于Cu2+被还原为Cu0簇拥在单链DNA上，从而阻