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基于多个核基因序列1株皮伞属菌株鉴定 　　摘要：提取在北京市房山地区野外环境中采集的1株野生菌子实体的基因组DNA，并以此为模板进行ITS、LSU和SSU片段的扩增、测序及比对分析。结果发现，从菌丝体基因组DNA中扩增获得了700 bp左右的ITS片段、850 bp左右的LSU片段和1 800 bp左右的SSU片段，经序列测定及比对，表明该真菌是Marasmiellus属菌株。建立了一种野生真菌快速、准确的鉴定方法。 　　关键词：皮伞属；分子鉴定；ITS；LSU；SSU 　　中图分类号： S646.01 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）03-0024-02 　　我国地域广阔，野生食用菌资源丰富、种类繁多、分布广泛、蕴藏量大。野生食用菌分类鉴定是涉及资源保护利用及产业发展的一项基础性研究工作[1]。随着分子生物学技术的广泛应用，从分子的层面上对野生菌进行快速、有效的鉴定，为野生菌的鉴定、开发及利用提供了很大的便利[2]。本研究对北京市房山地区采集的1株野生菌进行分子鉴定，并通过多个核基因序列的测定及比对分析，从而对该野生菌株的遗传地位进行解析，为该野生菌的开发利用奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试验材料 子实体，采集自北京市房山区东湖港风景区的野生菌。 　　1.1.2 试剂 基因组DNA提取试剂盒Dneasy Plant Mini Kit和凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购自德国QIAgen公司；TaKaRa PCR Mix购自大连宝生物公司；琼脂糖购自Invitrogen公司。 　　1.1.3 仪器 PCR仪（BIO-RAD，mycycler）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、电泳仪（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、离心机（Eppendorf 5418）、移液器（Eppendorf）等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组DNA的提取 取少量子实体于1.5 mL离心管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末状后，利用Dneasy Plant mini Kit试剂盒（QIAgen，货号：69104）说明书进行DNA的提取。 　　1.2.2 ITS-PCR扩增 选取ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为引物[3]，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增。扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 7 min；降至4 ℃结束。反应体系为50 μL。然后进行电泳检测。 　　1.2.3 LSU-PCR扩增 　　选取LR5（5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′，http：///fungi/mycolab/primers.htm）和LROR（5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′，http：///fungi/mycolab/primers.htm）为引物，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增。扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min；降至4 ℃结束。反应体系为 50 μL。然后进行电泳检测。 　　1.2.4 SSU-PCR扩增 　　选取NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，http：///fungi/mycolab/primers.htm）和NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，http：///fungi/mycolab/primers.htm）为引物，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min；降至4 ℃结束。反应体系为50 μL。然后进行电泳检测。 　　1.2.4 PCR产物测序及分析 　　PCR产物经过切胶回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司利用PCR扩增引物为测序引物进行测序。测序结果经过DNAMAN5.2.9和Chromas Pro软件进行碱基修正与拼接，最终获得的ITS、LSU和SSU序列提交到GenBank 核酸序列数据库（http：//），并与数据库中已知的相关序列进行比对。 　　2 结果与分析 　　2.1 PCR扩增结果 　　以所获得的基因组DNA为模板，以材料与方法中所列的引物进行PCR扩增，结果如图1所示，所得ITS产物片段大小为700 bp左右，LSU产物片段大小为850 bp左右，SSU产物片段大小为1 8