基于核酸外切酶Ⅲ信号放大比率型荧光传感器检测致病菌基因.docVIP

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大比率型荧光传感器检测致病菌基因 　　摘 要 食源性致病菌严重威胁着公众健康。本研究基于荧光共振能量转移原理，以Cy3和Cy5作为荧光供体和受体基团，利用核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）增强检测信号，构建了比率型荧光传感器，用于高灵敏度检测致病菌基因。分别标记有Cy3的R1-DNA和标记Cy5的R2-DNA形成双链R1/R2，在Cy3的激发光波长激发下，由于发生荧光共振能量转移，Cy3的荧光被猝灭而产生Cy5的荧光信号。致病菌靶基因（大肠杆菌Lac Z 基因）的存在可将R1/R2双链解旋，使得Cy3远离Cy5，导致Cy3的荧光恢复而Cy5的荧光信号降低。在Exo Ⅲ作用下，Cy3与Cy5的信号变化进一步增大。在优化的实验条件下，荧光信号变化与靶基因在10～2000 pmol/L浓度范围内呈现良好的线性关系，检出限为5.29 pmol/L。所采用的比率型信号检测策略极大地降低了假阴性、假阳性检测结果的产生，增强了检测特异性。 　　关键词 大肠杆菌；致病菌基因；荧光共振能量转移；核酸外切酶Ⅲ；比率型荧光生物传感器 　　1 引 言 　　食源性致病菌被公认为是影响全球食品安全的首要问题。食品中常见的致病菌有弯曲杆菌（Campylobacter spp.）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella spp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）及大肠杆菌（Escherichia coli）[1，2]。食用致病菌污染的食物可导致胃肠道疾病，严重的会损害脑及内脏器官，甚至引起死亡[3]，严重威胁着公众健康，并导致重大经济损失[4]。高灵敏检测致病菌已经成为确保食品安全和质量的重要手段。 　　目前常用的食源性致病菌检测方法有传统微生物检验法[5]、免疫学检测方法[6]和快速基因检测技术[7～9]等。传统的检测方法不仅操作复杂、耗时长， 且灵敏度较低，不能满足目前食品安全快速检测的要求。检测致病菌的特定序列核酸具有重要意义，发展简单、快速、灵敏度高和准确性好的致病菌基因检测方法已成为研究热点[10]。等温扩增策略已广泛应用于核酸检测中[11]，其中核酸外切酶Ⅲ信号放大是近年来采用较多的灵敏检测方法，此策略操作简便、易于设计，核酸外切酶Ⅲ无需特定识别位点，作用于双链DNA，沿3端逐步催化去除单核苷酸，对3突出末端双链DNA或单链DNA无活性[12]。 　　荧光检测方法具有灵敏度高、易操作等优势，在许多领域应用广泛。目前所发展的检测致病菌基因的荧光生物传感器通常只有单一信号输出，仅可基于检测信号增高（Signal-on）或者基于检测信号降低（Signal-off），可能会出现假阳性或假阴性的检测结果[2，5，8，9，13，14]。而具有两种荧光检测信号的比率型生物传感器则可克服以上不足。靶分子的存在会引起一种荧光基团信号增强，而另一种荧光基团信号降低，该策略不仅可提高检测灵敏度，还可增强检测特异性[14～16]。荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）原理已广泛用于检测DNA[8]、RNA[14，17]、金属离子[18]、双酚A（Bisphenol A）[19]、细菌[20]等，在生物、食品和医学等领域具有重要的意义[20]。本研究发展了一种基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光生物传感器用于致病菌基因检测，比率型检测策略提高了检测灵敏度和选择性，建立的检测方法在食品安全监管等方面具有良好的应用前景。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Lumina荧光分光光度仪、EV300紫外-可见光分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；5804R高速离心机（德国Eppendorf公司）；Bio-rad ChemDoc XRS凝?z成像系统（美国Bio-Rad公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。 　　乙酸（HAc）、HCl、NaCl（国药集团化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA?2H2O）、硼酸（美国Sigma-Aldrich公司）；过硫酸铵、SYBR Gold（北京索莱宝科技有限公司）；核酸外切酶Ⅲ、NE Buffer 1（美国New England Biolabs公司）。试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（18.25 MΩ?cm）；所有核酸序列均由上海生物生工有限公司合成，其序列见表1。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 DNA浓度测定 DNA浓度以单链浓度表示，