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基于自动磁珠转运转基因蛋白Cry1Ab检测 　　摘 要 基于自动磁珠转运，建立了转基因蛋白Cry1Ab免疫检测的新方法。利用水热法制备了粒径约400 nm的纳米磁球，并进行电镜表征，通过溶胶法对磁球表面进行氨基修饰，采用戊二醛偶联对磁珠实现抗体包被，在核酸提取仪中进行酶联免疫反应，采用分光光度法进行检测。本方法对转基因蛋白Cry1Ab的检出限低于1 　　 g/L，与商品化酶联免疫试剂盒相当。本方法节约人力、严格控制时间，同时，所需设备成本较低，有望取代传统的手动检测技术。 　　关键词 转基因作物； 磁分离； Cry1Ab蛋白； 磁珠转运； 免疫检测 　　 　　1 引 言?? 　　转基因作物（GMOs）因其先进的生物技术优势而发展迅速。在1996～2008年期间，种植面积增幅高达74倍，每年的增长率超过9%。虽然转基因作物有其独特的生物技术优势，但其对人和动物及环境的风险尚未得到充分评估。如潜在的物种间基因流动、破坏生物多样性、增强害虫的抗药性和对人类健康的威胁等因素，尚无法排除。因此，一些国家对转基因作物进行了立法，要求对含有转基因成分超过1%的产品进行强制标识，该含量后被降至0.9%。快速检测GMOs成分是这些法规能否有效实施的关键。《Analytical and Bioanalytical Chemistry》期刊于2010年3月就GMOs检测分析技术出版了专刊。?? 　　目前，检测转基因生物及其制品的技术可分为两大类: 基于核酸的检测和基于蛋白质的检测。核酸检测是检测其插入的外源基因，以聚合酶链式反应（PCR）为主。PCR法灵敏度高，但操作复杂，对测试人员有较高的技能要求； 另外， 它耗时长、成本高和难以实现高通量检测等也限制着其应用。蛋白层面的检测以免疫分析最为成功，包括酶联免疫吸附试剂盒（ELISA kit）和金胶试纸等。ELISA对操作的要求相对PCR要简单，但对操作人员的技能要求也很重要。试纸条操作简单，成本低廉，能较好地实现现场检测，但难以用于定量分析。另外，免疫生物传感器等新兴技术也被用于蛋白检测。?? 　　生物磁珠因其优良的抗原捕捉能力而备受关注。利用磁珠转运可以方便地实现各种生化反应步骤，而不需要复杂的流体控制系统。目前，磁珠转运应用于核酸提取和纯化的研究及装置较多，而除了医院所使用的大型免疫磁分离发光检测系统需要复杂流路控制外，用于免疫分析的报道较少。利用磁珠自动转运可以使操作流程更为标准化、统一化，同时降低操作劳动强度，对操作时间和条件的控制也十分精准。本研究利用自制的免疫磁珠，结合现有的核酸提取仪，通过免疫磁珠转运实现了对转基因蛋白Cry1Ab的检测。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂?? 　　SK3300HP超声清洗器（科导公司）；BS224型电子天平（德国Sartorius公司）； 电动搅拌机和涡旋振荡器（德国IKA公司）； M5多功能酶标仪（美国MD公司）； 核酸提取仪（杭州博日公司）； 单道和八道移液器（德国Eppendorf公司）； JEM-1200EX透射电镜（日本JEOL公司）； 低温磁场测试和试样制备系统（美国Quantum Design公司）； 实验用水通过去离子水机（美国Millipore公司）制备。 ?? 　　Cry1Ab蛋白一抗（鼠单抗）和酶联免疫试剂盒（美国Abraxis LLC公司）； 戊二醛、正硅酸乙酯（TEOS）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、牛血清白蛋白（BSA）、六水合三氯化铁（FeCl??3#8226;6H??2O）， 购自美国Sigma-Aldrich公司；四甲基联苯胺（TMB）单组分显色底物（天津天健公司）。所用试剂均为分析纯； 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）和PBST缓冲液（含0.1%吐温20的PBS, pH 7.4）。 　　 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 水热法制备Fe??3O??4纳米磁珠 综合文献\的方法合成磁珠。简言之，在25 mL内衬聚四氟乙烯的高压反应釜中，加入0.719 g FeCl??3 #8226; 6H??2O、1.2 g 醋酸钠、0.48 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和15 mL乙二醇，磁力搅拌20 min使之混合均匀；然后将反应釜盖牢置于温度为160 　　??SymbolpB@ C的烘箱中反应24 h，待其自然冷却后, 将釜内反应产物进行离心或磁分离，再经乙醇和去离子水交替清洗3次，置于真空干燥箱中60 　　??SymbolpB@ C干燥8 h,得到黑色粉末。 　　2.2.2 磁珠的表面修饰 参见文献\的方法，在磁珠表面修饰SiO??2层，制备Fe??3O??4@ SiO??2磁珠。简言之，取40 mg裸磁珠溶于20 mL乙醇，超声分散，加入12