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大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品研究进展 　　动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年， 其规模不断的扩大， 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，， 而大规模动物细胞培养技术已经成为生物技术制药中非常重要的环节。目前， 大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品上面，也已经开始了一些大规模的生产应用，细胞大规模培养技术作为行业技术升级改革的重要内容，农业部自2012年2月1日起，停止受理转瓶培养生产方式的的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。因此，传统转瓶工艺的应用越来越受到限制使用。自从20世纪60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，细胞悬浮培养已是当前国际上生物制品生产的主流模式。动物细胞有悬浮培养和贴壁培养两种，技术水平的提高主要集中在培养规模的扩大、细胞培养环境的优化、细胞特性的改变、不断提高产品的产量及保证其质量上。本文就大规模动物细胞培养技术在兽用疫苗上的应用进行综述，分析了其在?F用生物制品产业的发展趋势。 　　一、动物细胞培养方法 　　1.贴壁培养 　　贴壁培养是指细胞贴附在某种载体上，载体悬浮在反应器里的培养方法，一切贴壁型细胞都能够适用于贴壁培养。在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、PK―15细胞、ST细胞和Vero细胞等。由于贴壁细胞具有贴壁的要求，提高细胞的密度就是使细胞培养规模最大化的有效方法。传统的贴壁细胞培养包括方瓶、扁瓶、转瓶等。但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较复杂，所占空间大，劳动量也大，贴附面积具有限制性，在实际生产使用中受到极大的限制。目前，贴壁细胞的微载体培养在细胞生产中得到广泛的应用。 　　2.悬浮培养 　　悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便，细胞经过一定程度的驯化培养后，直接悬浮在适宜的液体培养基中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。传代时也不需要再进行分散，只需要添加一定比例的培养基即可继续生长。目前用于悬浮培养的细胞也在逐渐增加，以前主要有昆虫细胞和杂交瘤细胞等，现在发展到BHK-21和sk6细胞等，悬浮培养培养的规模大，操作工艺也简单，培养的细胞增殖快，而且产量高，是大规模培养动物细胞的首选模式之一。 　　3.动物细胞的大规模培养 　　动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬浮培养的基础上，参考了早期的流式细胞培养术、融合了固定化细胞培养技术、填充床培养技术、更是汇合了人工灌流和搅拌系统等生物反应器培养技术发展起来的，目前已广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等，已成为医药生物高技术产业的重要组成部分。目前较成熟且有应用价值的规模化培养方法主要包括：中空纤维法、微囊法和微载体法等。 　　空心纤维法：空心纤维培养法是Richard krrcazek等在1972年创建的，最初使用的空心纤维是由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为1/3～3/4mm，表面具有海绵多孔结构，能水分子、营养物质和气体透过，也能让细胞贴附在上面生长。这种培养系统的核心部分是由3～6层这样的空心纤维组成的，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到一定密度时，细胞不再增殖，但能正常维持并继续分泌所需的蛋白质或其他生物物质。这种培养方式在分离和纯化细胞分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。 　　微囊法：微囊细胞培养法是美国Damon Biotech公司创建的一种比较理想的大规模动物细胞培养方法，其基本技术是先将要培养的动物细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过成滴装置（微囊发生器）逐滴滴入CaCl2溶液中，海藻酸钠一进入CaCl2溶液后即形成半透膜微囊，从而将细胞封闭在内，然后将包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。培养液中的营养物质可通过半透膜进入微囊提供给细胞，细胞的代谢产物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻拦而积累与囊内。当培养一段时间后，在细胞密度达到107/ml时，分离收集微囊，最后破开微囊就可获得高度纯化的大分子产物。 　　微载体法：微载体培养法是Wezel在1967年创建的。采用的微载体是由天然的葡聚糖、纤维素或胶原等物质制成固体小球，直径在60―250微米。其原理是将对细胞无害的微载体加入到培养液中，作为载体，使细胞贴附于载体表面生长，同时通过持续搅拌使将载体均匀悬浮于培养液中，微载体方法不但能使细胞均匀分布，也提供了极大的培养表面积/体积比，因此单位体积培养液的细胞产率高，将悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两则的特点，适用于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，而且放大生产也较容易。因而是一种比较理想的培养方法，只是此法对载体要求较高。 　　4.用于病毒生产的细胞系