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大肠杆菌噬菌体研究进展 　　摘要： 大肠杆菌病为畜牧养殖业常见疾病之一，目前临床上主要依赖于抗生素进行控制。随着大肠杆菌耐药性增强以及人们对食品安全意识的提高，急需寻找安全、高效的抗生素替代品。噬菌体是能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，具有巨大的潜在应用价值。对近几年国内外有关大肠杆菌噬菌体的分布、分离纯化方法、保存方法、形态、pH值稳定性、温度稳定性、分子生物学以及应用方面作了简要概述，并对以后的科研和应用进行了思考和展望。 　　关键词： 大肠杆菌；噬菌体；研究进展 　　中图分类号：S852.61+2 文献标志码： A[HK] 　　文章编号：1002-1302（2015）08-0008-03 　　近年来，由于畜牧养殖业大量使用抗生素，导致病原微生物的耐药性升高 [1]，同时，抗生素的使用对食品安全构成威胁。噬菌体作为一类能够感染和裂解大肠杆菌等微生物的病毒，具有宿主专一、不产生耐药性 [2]、使用安全 [3-4]等优势，在美国已应用于儿童腹泻疾病的治疗 [5]。因此，噬菌体有望在防控畜牧业肠道性疾病中替代抗生素。本文对近几年国内外关于大肠杆菌噬菌体的分离和保存方法、生物学特性等进行综述，希望能够对大肠杆菌噬菌体更深入的研究和应用提供思路和方法。 　　1 大肠杆菌噬菌体的分布 　　目前研究发现的病毒种类数量庞大，其中大部分是噬菌体 [6]。大肠杆菌噬菌体在我们生活的周围环境中普遍存在。到目前为止，学者们已经从不同的样品中分离出来多种大肠杆菌噬菌体，并对所分离的噬菌体进行了分类和命名。在养殖场的鸡粪 [7-8]和污水中 [9]，以不同的大肠杆菌为宿主菌分离到不同种类的大肠杆菌噬菌体；在养猪场的粪便中，以产肠毒素性大肠杆菌K88 为宿主菌分离并纯化了1株噬菌体PK88-4 [10]；在城市的污水中，以肠出血性大肠杆菌O157 ∶ H7为宿主菌分离出裂性噬菌体 [11]。此外，在医院的污水中，用大肠杆菌E1～ E17共17种细菌做指示菌分离出1种广谱噬菌体IME11 [12]。 　　2 大肠杆菌噬菌体的分离纯化方法 　　对于噬菌体的分离纯化，大致可以分为采样、富集、分离、纯化4个步骤。每个步骤又包含1种或多种不同的方法，可以根据自身的试验条件和试验状况将不同方法组合，进而得到最佳的分离纯化方法。 　　2.1 采样 　　采样大致可以分为直接法、间接法和诱导法 [13]3种。直接法是指直接从对象菌生活的生物体上采集样本的方法。李灏等 [14]、Connerton [15]都采用直接法从发病鸡的肠道中采样并分别分离出大肠杆菌噬菌体和空肠弯曲杆菌噬菌体。间接法是指根据对象菌的特性，从相应的非生物坏境中采集样本的方法。如从养鸡场的污水、粪便和土壤中采样进而分离噬菌体 [8-9，16-17]。诱导法是指用对象菌去感染生物体进而在生物体或其生活环境中采样的方法。郭海萍等用痢疾志贺氏菌感染小鼠，采取小鼠的粪便进而分离得到相应噬菌体。 　　2.2 富集 　　富集也称增殖，即将对象菌悬液与样品液共同培养，增加样品液中噬菌体的含量，富集之后的样品液更易分离出噬菌体。郭秋菊等从生活污水中采样分离噬菌体，进行了富集和不富集的对照试验，结果显示，富集之后的样品很容易检测到噬菌体，而不经富集的样品未检测到噬菌体 [19]。虽然不经富集的样品中未检测到噬菌体，但并不表示样品中不含噬菌体。 　　2.3 分离 　　分离方法可以分为双层琼脂平板法、琼脂平板涂布法、琼脂平板倾注法3种 [13]。各种方法有自己的优缺点，学者们通常根据自己的试验条件和操作习惯进行选择。 　　2.4 纯化 　　纯化可以分为液体纯化法和平板纯化法 [13]。液体纯化法中，用无菌枪头或牙签挑单个噬菌斑，然后接入含对象菌的液体培养基中进行适温培养，再经过滤除菌即得到纯化噬菌体 [20]。平板纯化法中，也是用无菌枪头或牙签挑单个噬菌斑于缓冲液进行洗脱，洗脱液经适当稀释后再用双层琼脂平板法、琼脂平板涂布法或琼脂平板倾注法进行培养，如此操作 3～5次，即可得到纯化噬菌体 [10，19]。 　　3 大肠杆菌噬菌体的保存方法 　　在对噬菌体的保存方法上，研究学者们尝试过很多种方法，不同的保存方法对噬菌体活性的保持影响很大。 　　陈萍等取3组500 μL噬菌体裂解液：第一组加入了 100 μL 氯仿，第二组加入500 μL LB液体培养基，第三组加入CaCl2和MgCl2至终浓度10 mmol/L、0. 1%明胶， 4 ℃ 保存1个月，结果显示第三组噬菌体的活性很少降低，效价最高 [21]。 　　有很多关于-18 ℃保存噬菌体的研究。陈海阳将1株广谱大肠杆菌噬菌体EX01裂解液放于-18 ℃低温保存，每隔一周测定其效价，结果显示噬菌体EX01在35