姬松茸子实体多糖ABMB3 对小鼠免疫功能影响.docVIP

姬松茸子实体多糖ABMB3 对小鼠免疫功能影响 　　姬松茸(Agaricus blazei )属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、蘑菇科(Agaricaceae)、蘑菇属(Agaricus),是一种美味的食、药用真菌。姬松茸含有多种生物活性物质,具有防癌抗癌、降血脂、改善动脉硬化、防治糖尿病和增强人体免疫力等功效[1]。 　　研究证明姬松茸提取物具有提高免疫力和抑制肿瘤的功能,如ITO等发现,从姬松茸子实体中提取的1,6 SymbolbA@D 葡聚糖具有抑制S 180小鼠腹水瘤细胞生长的功效[2];OHNO等发现姬松茸子实体的碱性提取物具有很好的抑制S 180小鼠腹水瘤细胞增长的作用,而且证明高分支的1,3 SymbolbA@D 葡聚糖在抗肿瘤过程中起重要作用 [3];NAKAJIMA等研究发现姬松茸子实体沸水提取物不但具有刺激小鼠T细胞和巨噬细胞分泌白细胞介素1β( Interleukin 1β,IL 1β)和IL 6的作用,而且能刺激小鼠产生大量抗体[4]。MIZUNO等研究发现从姬松茸中提取的水溶性和水不溶性SymbolbA@葡聚糖是主要的抗肿瘤组分[5,6]等。本文主要探讨姬松茸子实体多糖ABMB3对小鼠淋巴细胞免疫球蛋白以及细胞因子分泌的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1样品来源 　　姬松茸(A. blazei)子实体购于福建省古田镇。 　　1.1.2实验动物 　　Balb/c 小鼠,8 10周龄,雌雄不拘,购自Zentralinstitut für Versuchstierzucht (Hannover),由柏林自由大学医学院动物房饲养。 　　1.1.3试剂 　　羊抗鼠 Ig多克隆抗体、小鼠IgG和IgM (Pharmingen 公司);脂多糖 (LPS)(Calbiochem公司);植物血凝素(PHA)(Sigma公司);DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S 300HR(GE公司);培养基RPMI1640(Biochrom KG公司),热灭活的小牛血清(Kraeber公司),牛血清白蛋白(BSA)(Sigma 公司),青霉素(Boehringer Mannheim 公司)、链霉素(Glutamine Merck公司);Alamar Blue试剂、IgG、IgM、IL 4、IL 6、IL 2和 IFN SymbolgA@ 各检测试剂盒( RD公司);磷酸盐缓冲液(PBS)等其它常用化学试剂均为Sigma公司的产品。 　　1.2方法 　　1.2.1ABMB3的获得 　　将1 kg姬松茸子实体分别用40 L蒸馏水100 ℃提取3次,每次1 h,滤布过滤,合并滤液浓缩后,用10 000分子量透析袋透析。袋内大分子部分过DEAE Sepharose Fast Flow柱,用NaCl (0~2 mol/L)梯度洗脱,盐相成分2过凝胶柱 Sephacryl S 300HR,经离子色谱检测,半乳糖与葡萄糖比例为1∶5的组分为多糖ABMB3。冷冻干燥后溶于PBS中,配成2 mg/mL的ABMB3溶液,20 000 g离心30 min除菌后备用。 　　贾 薇,等:姬松茸子实体多糖ABMB3 对小鼠免疫功能的影响 　　1.2.2小鼠脾淋巴细胞的制备 　　小鼠脾淋巴细胞的制备按参考文献[7]的方法进行。 　　1.2.3ABMB3作用浓度筛选 　　分别测定浓度为10、50、200、500、1000 μg/mL ABMB3对小鼠脾淋巴细胞的增殖率,以筛选其作用浓度,按参考文献[7]的方法进行。 　　1.2.4免疫球蛋白的测定 　　将180 μL淋巴细胞悬浮液(2 　　SymboltB@ 106个/mL)加至96孔板中,分别加入20 μL 2 mg/mL ABMB3、500 μg/mL LPS、60 μg/mL PHA,以等体积的PBS溶液做阴性对照,于37 ℃、5% CO??2 的条件下培养2~14 d。从第2天开始隔天取样,上清液 20 ℃保存备用。 　　将100 μL浓度为0.2 μg/mL 的羊抗鼠Ig多克隆抗体 加入到96孔板中,锡箔纸覆盖4 ℃过夜,用0.1%的Tween PBS溶液洗涤5次,加入含1% BSA的 PBS溶液室温培养1 h封闭掉非特异性的抗体结合位点,洗涤5次后,分别加入100 μL样品、IgG标准样品培养2 h,用IgG检测试剂盒测定免疫球蛋白含量,操作步骤按说明书进行。 　　IgM的测定步骤同上。 　　1.2.5细胞因子的测定 　　将180 μL淋巴细胞悬浮液(2SymboltB@ 106个细胞/mL)加至96孔板中,