姜黄素干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮间质转化影响及相关机制研究.docVIP

姜黄素干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮间质转化影响及相关机制研究 　　[摘要] 目的 探讨姜黄素对耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞的生物学特性影响以及干预其上皮间质化过程（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的相关机制。 方法 采用体外姜黄素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞；分别通过形态学、MTT法、transwell实验检测经姜黄素干预的耐药细胞株的形态特征、药物敏感性和侵袭转移能力的变化；通过Western blot实验检测波形蛋白、上皮钙粘附分子在药物作用后的表达差异以及PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关蛋白 AKT、mTOR的变化情况。 结果 与人肺腺癌PC9细胞比较，PC9/ZD耐药细胞株呈间质样细胞表型；与亲代PC9/ZD细胞比较，经姜黄素作用后的PC9/ZD细胞对吉非替尼敏感性明显增强，转移能力减弱（75.67±8.82 vs 103.67±13.67）；侵袭能力减弱（17.22±3.63 vs 59.89±8.19）；波形蛋白表达下调（1.07±0.23 vs 1.28±0.28），上皮钙粘附分子表达上调（0.82±0.27 vs 0.29±0.11）；AKT、mTOR磷酸化减弱（0.20±0.05 vs 0.63±0.17，0.72±0.25 vs 1.10±0.19）。 结论 姜黄素可以通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路而明显干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮-间质转化过程。 　　[关键词] 肺腺癌；吉非替尼耐药；上皮间质转化；生物学特性；姜黄素 　　[中图分类号] R285.5；R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）32-0001-04 　　吉非替尼作为一种常规治疗肺癌的化疗药物，在临床上有着不错的疗效，但还有很多肺癌患者会出现原发性耐药或继发性耐药的现象。已有研究表明肿瘤细胞发生上皮间质转化是其获得耐药能力的重要因素之一[1，2]。目前，姜黄素公认为是姜黄中最有效和最丰富的活性成分之一。一方面，姜黄素的抗炎、抗凝、抗氧化等作用不断被人们所证实[3]；另一方面，姜黄素的抗肿瘤机制也成为热点[4]。本研究通过体外姜黄素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞，对其进行分子生物学特性的检测，分析其干预EMT过程的相关机制，旨在为进一步研究姜黄素干预肺腺癌耐药细胞发生EMT时所涉及的相关转录因子或相关通路打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂和材料 　　①吉非替尼（Gefitinib）（阿斯利康制药有限公司产品）；②DMEM培养基、胎牛血清（Thermo公司产品）；③胰酶、PBS溶液（Hyclone公司产品）；④人结肠癌PC9细胞株（南京凯基生物科技发展有限公司）；⑤人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株（同济大学医学院提供）；⑥甲基偶氮唑蓝（MTT）、山羊抗兔IgG二抗、β-actin（biosharp公司产品）；⑦Matrigel胶、transwell小室、培养瓶、离心管（美国CORNING公司）；⑧E-cadherin、Vimentin、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、GAPDH一抗（Abcam公司）。 　　1.2 细胞形态学 　　采用倒置相差显微镜（OLYMPUS 200×）观察人肺腺癌PC9细胞株和人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株。 　　1.3 常规细胞培养 　　将处于对数生长期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD细胞株接种至5 cm×5 cm大小的培养瓶，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞铺满培养瓶80%左右进行传代。可将细胞冻存在-80℃的超低温冰箱中，解冻后细胞活力正常。 　　1.4 吉非替尼对细胞抑制率的测定 　　消化离心正常生长的耐吉非替尼PC9/ZD细胞株，并调整细胞浓度为3×104个/mL，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液（边缘孔用无菌PBS填充）平均分为对照组和实验组，均加入用稀盐酸溶解过滤后浓度为10 μg/mL的吉非替尼药物溶液，调整每孔吉非替尼浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL，并在实验组的小孔中加入姜黄素（Cur），并调整每孔Cur含量为60 μmol/L。设置4个复孔。继续培养48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL；置于培养箱4 h后吸去上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡3 min；采用全自动酶标仪（美国Bio-Tex）检测波长为490 nm的吸光度（OD值）。计算抑制率，公式为=（1-实验组/对照组）×100%。 　　1.5 transwell实验检测细胞转移和侵袭能力 　　①转移实验：消化离心正常生长的耐吉非替尼PC9/ZD细胞株，调整细胞浓