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姜黄素抑制视网膜色素上皮细胞增生实验研究 　　【摘要】 目的：观察姜黄素对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促进人视网膜色素上皮细胞（RPE）增殖的抑制作用。方法：取体外培养的人RPE细胞，分为空白组（加入1%小牛血清培养液）、对照组（加入1%小牛血清及5 ng/ml bFGF的DMEM培养液）和实验组（加入1%小牛血清、5 ng/ml bFGF及加入5、10、20 mg/L姜黄素的DMEM培养液），MTT法检测姜黄素对bFGF促进的RPE细胞表达的影响。结果：10 mg/L处理组48 h和20 mg/L处理组24、48 h均能显著抑制bFGF诱导的RPE增殖（P0.05）。结论：姜黄素对bFGF所促进的人RPE的增殖具有抑制作用。 　　【关键词】 姜黄素； 碱性成纤维细胞生长因子； 视网膜色素上皮细胞 　　中图分类号 R774.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）7-0148-02 　　姜黄素具有抗感染、抗氧化、抗增殖作用，还可以抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，可以抑制RPE细胞的增殖。本实验观察姜黄素对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促进人RPE增殖的影响，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 RPE细胞 　　来源于笔者所在医院孕24周以上引产胎儿眼。 　　1.2 试剂 　　改良的Eagle培养基干粉（DMEM，美国Gibco公司生产）、胰蛋白酶（美国Sigma公司生产）、新生小牛血清（武汉博士德生物工程有限公司生产）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） （美国Promega公司生产）、姜黄素（成都司科华生物技术有限公司生产），其余试剂为国产分析纯。 　　1.3 实验仪器 　　低温高速离心机5417R型（德国Epondof公司生产）、CO2恒温培养箱MCO175型（日本SANYO公司生产）、相差显微镜（上海团结仪器制造厂生产）、全自动酶标仪960型（美国Sigma公司生产）、超低温冰箱（日本SANYO公司生产）、荧光倒置显微镜U-LH100HG型（日本Olympus公司生产）。 　　1.4 方法 　　1.4.1 人RPE细胞的获取 人RPE细胞取自供体眼球，在无菌条件下剖开眼球，弃去玻璃体和视网膜神经上皮，剪除神经上皮，制成眼杯。用PBS液漂洗眼杯，加2 ml 0.25%胰酶消化液，10 min后，吸出消化液，再加入2 ml消化液，在37 ℃条件下消化30 min，将所得细胞悬液加入含15%小牛血清培养基的离心管中。1000 r/min离心5 min后，弃上清，漂洗，加入5 ml含15%小牛血清的DMEM培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，根据培养液颜色决定换液时间，待细胞生长至融合状态后开始常规传代，取第二代RPE细胞进行鉴定。 　　1.4.2 姜黄素对RPE细胞增殖的影响 采用MTT法检测，取第四代RPE细胞用1%小牛血清的DMEM稀释成1×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μl，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，培养24 h后换液。本研究设空白组（加入1%小牛血清培养液）、对照组（加入1%小牛血清及5 ng/ml bFGF的DMEM培养液）和实验组（加入1%小牛血清、5 ng/ml bFGF及加入5、10、20 mg/L姜黄素的DMEM培养液）。分别培养24 h和48 h后每孔中加入200 μl MTT继续培养4 h，吸出上清液，加入150 μl DMSO，慢慢振荡使MTT完全溶解，使用自动酶标检测仪测定各孔吸光度（A）值。实验每组设3个平行样，重复3次。增殖抑制率=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。 　　1.4.3 细胞形态学观察 在相差显微镜下观察细胞形态。 　　1.5 统计学处理 　　所得数据采用SPSS 16.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用字2检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 RPE细胞培养及鉴定 　　在相差显微镜下初次分离的原代 RPE 细胞呈球形，胞浆中可看到大量黑色素颗粒，胞核透明。培养2～4 d后细胞贴壁变扁平，开始伸出伪足，呈不规则多角形，形态均一。传代后，胞浆中色素颗粒开始减少，传至3～4代后，胞浆内的黑色素颗粒消失，细胞向梭形方向发展。第4代RPE细胞经鼠抗人角蛋白染色鉴定，纯度95%。 　　2.2 姜黄素对RPE细胞形态的影响 　　正常培养的RPE细胞呈现多角形、梭形或扁圆形贴壁生长，bFGF处理组可见细胞增殖较快。加入5 mg/L姜黄素组24 h和48 h细胞形态未见明显异常，加入10 mg/L处理组24 h和加入20 mg/L处理组12 h可见有细胞表面变粗糙、折