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妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能研究 　　[摘要] 目的 研究妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的变化。 方法 选择2010年10月～2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象（妊娠高血压综合征组），同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组。分离两组患者外周血单个核细胞进行体外诱导培养以获得内皮祖细胞，并对其增殖、黏附、迁移能力进行检测。 结果 各组骨髓单个核细胞在体外培养下均能够获得内皮祖细胞，与对照组比较，妊娠高血压综合征组内皮祖细胞增殖、黏附、迁移能力均有不同程度的下降。 结论 妊娠高血压综合征的发生与循环内皮祖细胞功能的下调存在明显的相关性。 　　[关键词] 妊娠高血压综合征；内皮祖细胞；外周血单个核细胞 　　[中图分类号] R714.246 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（b）-0025-03 　　近年来大量的研究显示，妊娠期高血压的发生与血管内皮损伤之间存在着密不可分的联系，而在血管损伤修复中扮演着关键角色的内皮祖细胞（endothelial progenitor cell），其数量及功能的变化对于疾病的评估有着至关重要的作用。血管内皮祖细胞通常定居于骨髓，作为血管内皮细胞的前体，其不仅参与胚胎血管生成及血管再生，同时在特定的状态下，它可以进入外周血，迁移并归巢至发生损伤的血管部位，发挥重要的血管修复作用。既往的研究表明，妊娠高血压综合征患者体内的循环内皮祖细胞数量存在显著的减少，然而对于其功能状态的研究却很少。因此，在本研究中通过体外培养的方式对妊娠高血压综合征患者的循环内皮祖细胞进行培养扩增，并对其体外的功能状态进行检测，以探讨内皮祖细胞功能状态与妊娠期高血压综合征之间的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选择2010年10月～2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象（妊娠高血压综合征组），其中，年龄（28.5±3.7）岁；孕龄（35.2±4.1）周。所有病例的入选标准均符合乐杰主编的《妇产科学》（第6版）中妊娠期高血压疾病的诊断标准，并且除外多胎妊娠、妊娠心脏病、妊娠糖尿病和妊娠期哮喘。同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组，年龄（27.9±4.2）岁；孕龄（35.8±3.7）周。经统计学分析显示，两组在年龄、孕龄上差异无统计学意义（P 0.05），具有可比性。 　　1.2 主要试剂 　　内皮细胞培养基-2（EGM-2，瑞士Lonza公司）；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL，美国Molecular Probes公司）；FITC标记的血凝素（FITC-lectin，美国Sigma公司）；纤维连结蛋白（fibronectin，美国Hematological Technologies公司）；噻唑蓝（MTT，美国Duchfo公司）；淋巴细胞分离液（天津TBD公司）。 　　1.3 研究方法 　　1.3.1 循环内皮祖细胞体外培养 所有患者清晨空腹经肘静脉采集外周血20 mL，经过密度梯度离心收集外周血单个核细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）反复洗涤离心后，加入EGM-2培养基重新悬浮细胞并将其细胞密度调整至1×107/mL，将该细胞悬液接种至纤连蛋白包被的24孔板中，于37℃、5%CO2浓度的培养箱内进行细胞培养。培养至第3天用预热至37℃的PBS将未贴壁的细胞完全冲洗去除，更换新的培养液后对贴壁的细胞进行继续培养，以后采取隔日半量换液。 　　1.3.2 免疫荧光鉴定 在细胞培养至第7天时，培养基中加入DiI-acLDL使其终浓度为5 mg/L，于培养箱中继续培养4 h，经2%多聚甲醛固定、PBS洗涤后，在24孔板中于每孔加入含有5 mg/L FITC- lectin的PBS 0.2 mL，将其置于37℃温箱中孵育1 h，经PBS反复冲洗后于荧光显微镜下进行观察。显示红色荧光者为DiI-acLDL阳性细胞，显示绿色荧光者为FITC-lectin阳性细胞，经过Image J图像处理软件进行图像叠加呈现为黄色荧光的细胞（即双荧光阳性的细胞）被认为是内皮祖细胞。 　　1.3.3 细胞增殖能力检测 在细胞培养至第7天时，常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，并将其制备成密度为1×105/mL的单细胞悬液，于96孔板的每孔中加入0.2 mL细胞悬液，在37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养96 h，在培养时间结束的前4 h于每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL）。培养结束后，将培养基吸弃并加入100 μL DMSO，经振荡后用酶标仪检测其570 nm处的吸光度（A值）。 　　1.3.4 黏附能力检测 在细胞培养至第7天时，常规应用0.25%胰