实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中应用.docVIP

实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中应用 　　利用基因工程技术对基因组的构成进行改变，将一些比较优良的外源基因导入植物、动物或者微生物的体内，使其遗传物质、性状、营养价值或者品质向人们所需要的目标进行改变，从而获得产品或者以其为原材料进行加工后得到的食品，称为转基因食品。目前，我国在转基因作物种植方面也加大了力度，转基因作物的种植项目已经增加至25个，但是转基因食品在安全方面的问题还没有被人们所接受，因此，必须要加强对转基因食品进行有效的标识管理，严格控制外源基因的含量，但是这些都需要准确有效的基因检测技术。目前，在转基因食品检测方面的检测技术主要有两方面，分别是对外源基因表达产物进行检测和直接检测外源基因，其中对外源基因序列的检测是目前比较常见的检测方式，主要的方法是PCR方法，这个方法是以核心作为基础。随着科学技术水平的不断提高，实时荧光定量PCR 技术也随之出现，其结合PCR技术和探针杂交技术的优点，具有很高的灵敏度，是传统PCR技术的100倍左右，其检测原理是通过探测PCR工程中荧光信号的变化情况来定量DNA模板量。 　　实时荧光定量PCR技术的涵义 　　实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号的变化来对整个PCR的反应过程进行实时监控，根据荧光信号的强弱来及时获得特异性扩增产物的量，然后根据标准曲线来进行定量的检测方法。实时荧光定量PCR技术可以对DNA模板进行定量分析，具有灵敏度高、特异性和可靠性强、污染小、准确率高等优点。 　　实时荧光定量PCR技术的基本原理。在检测过程中，随着PCR反应循环数增加，反应过程所产生的DNA拷贝数也不断增加指数方式增加，然后逐渐转入平台期，这个时候实时荧光定量PCR就会对整个PCR反应过程进行实时检测，荧光信息的变化情况经过电脑会自动绘成一条曲线，然后根据曲线中的指数期内的节点的PCR产物的量来判断DNA模板的含量。 　　荧光阈值是以PCR 反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准差的10倍，一般要判断荧光信号是否可信就要看测出的荧光信号是不是在荧光阈值以上，这样可以定义一个样本的Ct值，Ct指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 　　常用方法。实时荧光定量PCR技术在化?W原理上可以分为两类，分别是非探针类和探针类；其中探针类是利用探针来指示扩增产物的增加，常用的方法有TaqMan探针法；非探针类是利用荧光染料来对扩增产物的增加进行实时监控，常用的有SYBR GreenⅠ检测法。 　　实时荧光定量PCR技术在转基因食品领域中的应用 　　定量分析策略。在实时荧光定量PCR技术中，模板定量方法主要有两种，分别是相对定量和绝对定量。（1）相对定量。主要是指在一定的样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化，相对定量又分为比较Ct值法和标准曲线法，主要是依据相对定量方法是否需要建立标准曲线来区分的。比较Ct值法是不需要建立标准曲线的，但是它的前提是以靶基因和内源控制物的扩增效率保持基本一致，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。这种方法计算出的相对定量结果通常比实际结果要高，误差较大。标准曲线法首先要准备好标准品，其中包括目的的基因和内参基因的标准品，然后根据设定的梯度进行准确的配比稀释，一般是以1/10的梯度倍比进行稀释，然后制成标准曲线，通过标准曲线得到目的基因和内参基因的值，并将这两个基因的比值作为定量的最后结果。这种方法所得出的结果根据某个参照物的量而言的，且这种方法制作起来比较简易，只需要知道标准品的稀释倍数就可以了。（2）绝对定量。主要是指已知的标准曲线来推算出未出的样本的定量。在使用这个方法时首先要克隆目的基因和参照基因的扩增片段，然后构建体外转录系统，通过体外转录获得已知拷贝数的标准品来构建标准曲线，这种方法具有 稳定、准确的优点。另外，如果要定量多种目的基因，就需要针对不同的目的基因制备不同的定量标准品，但是这样会影响到定量的效率。 　　选择目标序列。在转基因成本定量分析中通常选择转基因生物基因组中的外源序列作为目标序列，其中包括有启动子、终止子、目的基因等。根据检测的外源目标序列的不同分类，转基因食品在应用实时荧光定量PCR检测技术进行检测时有四种序列的检测，分别是通用序列检测、结构特异性序列检测、基因特异性序列检测和品系特异性序列检测。 　　通用序列检测