TIGAR调节TRX1核转运影响人脑胶质瘤细胞放射敏感性的作用机制研究-放射医学专业论文.docx

TIGAR 调节 TIGAR 调节 TRX1 核转运影响人脑胶质瘤细胞放射敏感性的作用机制研究 中文摘要 I I 中文摘要 目的：干扰 TP53 诱导的糖酵解及凋亡调节蛋白（TIGAR）表达可以增加人脑 胶质瘤细胞的放射敏感性，但其机制尚不明了。硫氧还原蛋白-1（TRX1）是一个 通过核转运参与电离辐射后 DNA 损伤修复过程的重要的还原蛋白。由于 TRX1 依 赖 NADPH 保持还原状态从而发挥功能，而在氧化应激条件下，增加 TIGAR 表达 有助于产生更多的 NADPH 从而帮助细胞对抗氧化。本课题试图通过改变 TIGAR 的表达水平，研究 TIGAR 对 TRX1 核转运的影响及其在调节胶质瘤细胞放射敏感 性中的作用，从而阐述 TIGAR 调节胶质瘤细胞放射敏感性的机制；通过比较 TIGAR 在胶质瘤细胞与正常胶质细胞中功能的差异，探讨 TIGAR 作为胶质瘤放疗 增敏靶点的可能性；最后，通过建立人脑胶质瘤裸鼠原位种植模型，验证 TIGAR 调节细胞放射敏感性的机制。达到阐明干扰 TIGAR 表达增加人脑胶质瘤放射敏感 性机制的目的。 方法：采用 Western blot 技术检测电离辐射对细胞 TIGAR 表达水平及 p53 蛋 白水平的影响；通过实时荧光定量 PCR 技术检测电离辐射后细胞 TIGAR、TP53 转录水平的改变；通过转染 TIGAR siRNA 干扰 TIGAR 表达，构建 pcDNA3.1-TIGAR 瞬时过表达 TIGAR；采用流式细胞技术、NADPH 检测试剂盒检测电离辐射前后 细胞的氧化还原水平；通过转染野生型 TRX1 过表达质粒（pcDNA3.1-WT-TRX1） 及突变型 TRX1 过表达质粒（pcDNA3.1-MT-TRX1）、G418 筛选得到野生型及突变 型 TRX1 稳定过表达细胞株；采用克隆形成试验检测电离辐射后细胞的克隆存活 率；通过免疫荧光技术评价电离辐射后不同时间点（0.5 - 12 h）胶质瘤细胞 DNA 损伤的修复水平；通过 Western blot 技术检测干扰 TIGAR 表达对细胞 TRX1 核转 运的影响；采用氧化还原 Western blot 技术检测电离辐射前后 TRX1 蛋白的氧化还 原水平。最后通过原位种植胶质瘤细胞建立人脑胶质瘤裸鼠原位种植模型；通过 原位注射 TIGAR shRNA 慢病毒实现基因治疗，并采用核磁共振成像（MRI）技术 评价基因治疗联合放疗的治疗效果。 结果：（1）电离辐射后，p53 野生型人脑胶质瘤 A172 细胞内 TIGAR 表达水 平在照后 1 h 开始增加，照后 8 h 回落至基础水平；p53 蛋白水平于照后 0.5 h 开始 中文摘要 TIGAR 调节 TRX1 核转运影响人脑胶质瘤细胞放射敏感性的作用机制研究 增加，先于 TIGAR 表达增加。而在受照的 p53 突变型（M237I）T98G 细胞中， TIGAR 与 p53 蛋白水平均无显著增加。克隆形成试验显示，干扰 TIGAR 表达显著 降低受照 A172、T98G 细胞克隆存活率。（2）干扰 TIGAR 表达显著增加受照胶质 瘤细胞内的活性氧（ROS）水平并造成受照细胞内 NADPH 水平耗竭，在单纯照射 组细胞内 NADPH 的含量仅较照射前下降了 40%，而 TIGAR 干扰联合照射组细胞 内 NADPH 的含量较照射前下降了约 75%。相似的，干扰 TIGAR 表达也引起了受 照胶质瘤细胞内 GSH/GSSG 比例的进一步下降，而 TIGAR 过表达则可显著增加受 照胶质瘤细胞内的 NADPH 含量与 GSH/GSSG 的比例。Western blot 结果显示，电 离辐射后细胞内 TRX1 可发生核转运，核转运的峰值时间为照后 2 h。而干扰 TIGAR 表达可显著抑制受照胶质瘤 A172、T98G 细胞内的 TRX1 核转运。（3）干扰 TIGAR 表达无法抑制野生型 TRX1 过表达 A172 细胞发生电离辐射诱导的 TRX1 核转运。 氧化还原 Western blot 结果表明 A172 细胞受照后，胞浆内 TRX1 于照后 0.5 h 内被 氧化，于照后 8 h 回复到还原状态，而干扰 TIGAR 表达可显著延缓细胞浆内 TRX1 的还原进程，结果显示胞浆内 TRX1 于照后 8 h 仍处于氧化状态。而在野生型 TRX1 过表达细胞内，TIGAR 干扰无法延缓 TRX1 的还原进程，电离辐射后细胞核内 TRX1 的氧化还原进程与细胞浆内 TRX1 类似，也可被干扰 TIGAR 表达延缓。克 隆形成试验的结果显示，野生型 TRX1 过表达可显著抑制 TIGAR