T4核酸内切酶V(T4N5)重组表达、纯化及脂质体包被-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 重庆理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究所取 得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写的成果、作品。对本文的研究做出重要贡献的集体和个人，均已在 文中以明确方式标明。 本人承担本声明的法律后果。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权重庆理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于（请在以下相应方框内打“√”）： 1.保密□，在 年解密后适用本授权书。 2.不保密□。 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 中文摘要 中文摘要 万方数据 万方数据 中文摘要 目的：采用融合表达方式获得 T4N5 蛋白，并对该蛋白进行脂质体包被。 方法：通过全基因合成技术获得含有凝血酶识别位点的基因序列，构建重组表达载 体 pET-32a-thrombin-T4N5。转化表达菌 Origami DE3 并筛选得到重组人 T4N5 的工 程菌。经基因测序和蛋白表达验证后，进行发酵表达。纯化回收的融合蛋白经凝血 酶酶切、镍亲和层析反相 C18 精纯化，获得高纯度的重组 T4N5 蛋白，并进行脂质体 包被，通过体外实验和动物实验，初步确定其活性。 结果：成功构建了重组载体 pET-32a-thrombin–T4N5，重组质粒转化表达菌 Origami DE3 构建的工程菌，经诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的 20%以上。凝血酶酶切 效率不低于 80%。制备的 T4N5，质谱分子量与理论值一致。质量肽图确定于理论 序列一致。制备的 T4N5 的纯度达到 90%以上。体内外活性测试结果显示，其具有 明显的修复紫外线导致的 DNA 损伤的能力 关键词：T4 核酸内切酶 V ；T4N5；重组表达；纯化；脂质体 I 英文摘要 英文摘要 万方数据 万方数据 Abstract Purpose: To prepare T4 endonuclease V (T4N5) by fusion expression in E.coli and then to coat it with liposome Methods: Constructing the recombinant expression vector pET-32a-thrombin-T4N5 through total gene synthesis the T4N5 gene sequences. These vectors were transformed into Origami DE3. The synthesized plasmid was sequenced and then protein expression is validated. The high-purity T4N5 was separated by nickel affinity chromatography and C18 reverse-phase chromatography from the fusion, which was cleavaged by the thrombin. The activity of T4N5, coated by liposomes, was detemirmined by in vitro and animal experiments. Result: Result: Recombinant vectors pET-32a-thrombin-T4N5 were successfully constructed The recombinant plasmids were transformed into Origami DE3. Induced with IPTG, the expression level of fusion protein was over 20% of total bacterial protein. The digestion efficiency is not less than 90%. The efficiency of thrombin was more than 80%. Molecular weight and amino acid sequence of prepared T4N5 was consistent with theoreti