Timeless通过结合Cry1aa负向调控斑马鱼生物钟-遗传学专业论文.docxVIP

Time Timeless 通过结合 Cry1aa 负向调控斑马鱼生物钟 中文摘要 I I PAGE IV PAGE IV 中文摘要 地球自转导致了昼夜交替变化。从低等单细胞生物到高等动物人类，对这种 昼夜循环的长期适应而演化出的计时机制即生物钟。生物钟调节大约 24 小时的周 期性生理和行为，包括饮食、睡眠和体温等。经典的生物钟反馈环路为 Clock 和 Bmal 蛋白形成异二聚体，随后激活下游 per 和 cry 基因的表达，Per 和 Cry 蛋白也 形成异二聚体从而抑制 Clock:Bmal 蛋白复合物的活性。 目前对于核心生物钟基因调控机制的研究主要集中在核心生物钟基因的解析 和功能研究，对于不同物种之间基因功能的演化还知之甚少。在果蝇中，timeless 是核心生物钟基因，对 per 进行转录后调节，在细胞核内定位和蛋白质稳定性等方 面起作用。在小鼠中，Timeless 的生物钟功能仍处于争论中，但其在生长发育中所 起的作用已被证实，靶向性敲除 Timeless 的小鼠会致死。而在斑马鱼的经典反馈 环路中，timeless 的定位和功能仍不清楚。 无脊椎动物中存在的两个 timeless 基因，而脊椎动物中只有一个。我们通过系 统树分析发现，斑马鱼的 timeless 与果蝇的 timeout（tim2）序列更为相似。实时定 量 PCR 方法发现，在幼鱼中，timeless 基因的表达呈现明显的节律性；而在 bmal1b 和 clock1a 突变体中，timeless 基因的表达呈现下调。我们发现 timeless 的启动子含 有多个 E’-box 和 E-like-box，通过 ChIP 实验发现 Bmal1b 蛋白可以结合到 ATG 上 游-6508 位置的 E’-box 上，并且通过体外细胞实展示包含有该 E’-box 的 timeless 的启动子可以被 Clock1a:Bmal1a 蛋白复合物激活，同时被生物钟负向因子 Cry1ba 所抑制。这些结果表明生物钟直接调控 timeless 的表达。 我们采用 TALEN（Transcription activator-like effector Nuclease）技术建立斑马 鱼 timeless 突变体，进一步研究该基因的功能。实时定量分析发现在 timeless 纯合 突变体幼体中核心生物钟基因（bmal1b、clock1a、cry1aa、per1b 和 per3）和生物 钟调控基因（aanat2）均呈现上调或部分上调，说明 timeless 为这些基因的正常表 达所必须；行为实验展示在持续黑暗条件下，timeless 突变体的运动周期与野生对 照延长半小时。而在突变体成鱼的各个组织中，timeless 基因自身的 mRNA 水平明 中文摘要 Timeless 通过结合 Cry1aa 负向调控斑马鱼生物钟 显下调并失去节律，而生物钟基因（bmal1b、clock1a、cry1aa、per2）基因的表达 受到不同程度的影响，说明在不同组织中，timeless 基因的功能具有组织特异性。 这些结果表明 timeless 在斑马鱼生物钟调控环路中起到不可或缺的作用。体外细胞 定 位 实 验 发 现 ，Timeless 在 核 内 和 细 胞 质 中 均 有 表 达 。 免 疫 共 沉 淀 实 验 表明 Timeless 通过 N-端的 LXXLL 结构域结合 Cry1aa，而不结合 Per1b、Per2 或 Cry1ba。 体外细胞转染实验表明 Timeless 可以通过结合 Cry1aa 而增强 Cry1aa 对生物钟环路 的抑制作用，而单独 Timeless 无抑制功能。因此，timeless 是斑马鱼生物钟重要的 调控元件。高通量深度测序分析在持续光暗条件下 timeless 突变体幼体在 CT 2 （11:00, 98 hpf）和 CT 14（23:00, 110 hpf）时与相应野生型对比的差异表达基因 发现，突变体中细胞周期和生长发育有关基因 spice1, smac1 和 tshz1 下调，而早期 生长应答因子 egr2a 基因上调。说明 timeless 基因除了在生物钟系统中发挥重要作 用之外，可能在斑马鱼的生长发育和细胞周期调节上也有一定的作用。 本研究阐明了斑马鱼 timeless 基因既直接受生物钟调控，又为斑马鱼生物钟调 节所需；Timeless 通过结合 Cry1aa 负向调节斑马鱼生物钟；Timeless 可能在斑马 鱼的生长发育和细胞周期上发挥调节作用。这些发现对于斑马鱼生物钟的分子机 制研究以及生物钟调节其他生命过程的研究有重要意义；为进一步完善现有的生 物钟环路以及后续的研究生物钟调控生命过程提供了基础。 关键词：生物钟