TNF-α通过上调脊髓背角NR1磷酸化表达介导大鼠痛觉过敏及异常疼痛-生理学专业论文.docxVIP

山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 I I TNF-α通过上调脊髓背角 NR1 磷酸化表达 介导大鼠痛觉过敏及异常疼痛 中 文 摘 要 传统的痛觉传导学说认为，疼痛是经外周，脊髓和脑中三级神经元的传递，最终被机 体感知的，常表现为不愉快的感觉或情绪体验。在痛觉传递的过程中，若受到内，外因素 的影响，就会出现异常性的疼痛，如痛觉过敏的发生。痛觉过敏作为一种异常的疼痛，主 要表现为对温和的伤害性刺激敏感性增强，并可以发生于从外周到中枢的多级水平。众所 周知，谷氨酸型 NMDA 受体在痛觉的突触传递中发挥着重要的作用。NMDA 受体的大量 开放，引起胞内 Ca2+浓度升高，是中枢敏感化发生的重要基础。经典的 NMDA 受体主要 是由 NR1 和 NR2 两个必须亚基构成的，这两个必须亚基可以受到多种因子的调节，从而 引起 NMDA 受体的开放或关闭。尤其是 NR1 亚基上的胞内羧基端（Ser896）存在有磷酸 化位点，有研究报道，该位点的磷酸化，可以调节 NMDA 受体活性，易化突触传递，从 而参与了痛觉过敏的发生。 近年来，越来越多的报道显示，不仅仅神经元参与了伤害性刺激的传递过程，胶质细 胞也在传递过程中发挥着巨大的作用。胶质细胞一旦被激活（如外周的炎症刺激 ），可以 释放一系列促炎症因子，如 TNF-α，IL-1β，IL-6 等，影响疼痛的传递，易化或者阻抑疼痛。 有研究显示，外周的损伤或者炎症可以引起脊髓中胶质细胞活化，进而快速释放 TNF-α， 参与易化脊髓 SH 神经元之间的突触传递。另有研究显示，在低位脑干的 RVM 区域的神经 元上， TNF-α受体 TNFR1 和 NR1 共表达，并且 TNF-α释放增多可以上调 p-NR1 的表达。 但在脊髓水平，外周炎症引起的 TNF-α释放增多是否也可以上调 p-NR1 的表达，还不清楚。 基于以上，我们进行如下实验设计，以证实是否脊髓 背角 TNF-α和其受体 TNFR1 通 过对 NR1 亚基的磷酸化作用，参与了大鼠痛觉过敏的发生。整个实验主要包括三部分：1） 通过对大鼠左后肢足底皮下注射 CFA 建立外周炎性痛模型，鞘内给予 TNFR1 抑制剂 anti-rTNF-α，观察大鼠热痛反应和左右两侧脊髓背角 NR1 磷酸化水平的表达；2）通过鞘 内直接给予 TNFR1 激动剂 rTNF-α和/或 TNFR1 抑制剂 anti-rTNF-α，观察 TNF-α增多和激 活或抑制 TNFR1 对大鼠热痛反应和左右两侧脊髓背角 NR1 磷酸化水平的影响；3）在大鼠 炎性痛模型的基础上，鞘内直接给予胶质细胞抑制剂 FC，对大鼠热痛反应和脊髓背角 NR1 II II 磷酸化水平进行检测。 实验动物全部采用雄性 Sprague-Dawley 大鼠（250-270g）进行，第一部分动物按照 2 ×2 双因素设计随机分为四组： Saline+Vehicle 在生理盐水左侧足底皮下注射前 24h， 2h，以及注射后的 23h，鞘内给予 PBS（0.01M, pH 7.4, 5 μl）于腰膨大处; CFA+Vehicle 在 CFA（0.08 ml, 40 μg Mycobacterium tuberculosis）左侧足底皮下注射前 24h，2h 以及 注射后的 23h，鞘内给予 PBS 于腰膨大处； Saline+anti-rTNF-α 在生理盐水（0.08 ml） 左侧足底皮下注射前 24h，2h 以及注射后的 23h，鞘内给予 TNF-α抑制剂 anti-rTNF-α （50 fmol / 5 μl 或 70 fmol / 5 μl）于腰膨大处； CFA+anti-rTNF-α 在 CFA 左侧足底皮下注射 前 24h，2h 以及注射后的 23h，鞘内给予 anti-rTNF-α（剂量同前）于腰膨大处。所有四组 均在外周 CFA 或生理盐水注射前 24h，注射后的 2h 和 24h 进行 PWL（缩足反射潜伏期） 热痛行为检测，并对 CFA 或生理盐水脚掌注射后 24h 的脊髓背角（左侧/右侧）磷酸化 NR1 的表达分别进行 Western Blot 检测。 热痛行为结果显示，相较对照组 Saline+Vehicle , CFA+ Vehicle 组在左侧足 底皮下注射 CFA 后的 2h 即出现明显的 PWL 下降，且 24h 后仍未出现恢复（P 0.05）；而 CFA+anti-rTNF-α 组结果显示，无论是鞘内给予 anti-rTNF-α是较低剂量的（50 fmol / 5 μl）还是较高剂量的（70fmol / 5 μl），二者均可抑制 PWL 的下降，而且显然在一定范围内， 随着抑制剂剂量的提高，反转 PWL 减少