γ GCS在狼疮性肾炎间质纤维化中的作用研究-内科学专业论文.docxVIP

广州医学院硕士学位论文γ-GC 广州医学院硕士学位论文 γ-GCS 在狼疮性肾炎间质纤维化中的作用研究 PAGE PAGE 4 著低于正常对照组，并与疾病活动密切相关，因而肾组织 GSH 水平是影响肾组织损 害发展到肾间质纤维化的一个重要因素；并且 GSH 还可以通过中和 ROS 抑制 TGF-β-1 诱导的 Pal-l 表达，促使 ECM 降解。氧化损害等多种刺激可不同程度调节肾 组织 GSH 浓度，其中一个重要的调节环节，就是转录水平调控 GSH 合成的限速酶 —γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)，从而调节细胞内 GSH 浓度，促进肾组织损伤修 复或保护肾组织免受氧化损害。 综上可知，在 LN 患者体内 GSH 水平降低代表抗氧化能力降低，体循环内各种 氧化因素直接对肾组织造成损害，并且介导 TGF-β1 的致纤维化作用。对 LN 肾组织 GSH 转录水平的调控因素 γ-GCS 的研究，将是对 LN 肾间质纤维化机制研究的一个 新的切入点。 研究目的： 1．对照正常小鼠，观察狼疮鼠模型 MRL/1pr 小鼠肾组织纤维化因子 TGF-β1 转 录水平和蛋白水平的表达改变。 2．对照正常小鼠观察 GSH 及其合成限速酶 γ-GCS 在 MRL/1pr 小鼠肾组织的表 达，评估狼疮鼠肾组织抗氧化能力的改变。探讨 MRL/1pr 小鼠肾组织 GSH 及 γ-GCS 表达改变在肾间质纤维化中的作用。 3．构建 γ-GCS-pEGFP-c1 真核表达质粒，培养原代狼疮小鼠肾小管上皮细胞。 为后续性研究 γ-GCS 在肾小管上皮细胞表达做前期准备。 方法： 1．分组 正常对照组：16 周龄 SPF 级 C57BL/6 雌性小鼠；LN 模型组：16 周龄 SPF 级 MRL/1pr 雌性小鼠，各 10 只。 2．组织染色观察肾组织病理。 3．用荧光定量 PCR 方法检测两组小鼠肾组织 γ-GCS 和纤维化因子 TGF-β1 的 mRNA 水平表达改变。 4．免疫组织化学法检测 TGF-β1 蛋白量改变。 5．westernbloting 检测肾组织 γ-GCS 蛋白表达量。比色法检测肾组织 GSH 水平。 6. 使用 PCR 方法克隆 γ-GCS 序列片段，重组到 pEGFP-c1 真核表达载体，酶消 化法培养原代肾小管上皮细胞。 7．用 SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据用均数±标准差( x ±s)表示，两样本比 较用 t 检验。P 0.05 为差异有统计学意义。 结果： 1．病理改变 光镜下 HE 染色切片可见，狼疮鼠组部分肾小管上皮细胞萎缩、脱 落，管腔扩张，及小管上皮细胞纤维化，局灶性的小管间质纤维化、空泡化，并可 见蛋白管型。 2．荧光定量 PCR 结果 采用半定量法对比 γ-GCS 和 TGF-β1 在 C57BL/6 和 MRL/1pr 小鼠的表达差异，狼疮小鼠组肾组织中 γ-GCS 的 mRNA 水平与正常小鼠组 比较表达减少，TGF-β1 的 mRNA 表达水平升高，差异有统计学意义，(p 均0.05)。 狼疮鼠肾组织 GSH 水平明显下降（p0.05）。 3．免疫组化结果 结果显示 TGF-β1 主要在肾小管上皮细胞胞浆较高表达。 MRL/1pr 小鼠的肾小管上皮细胞表达高于正常小鼠(p0.05)。免疫印迹结果证明 γ-GCS 在狼疮小鼠肾组织蛋白表达降低(p0.05)。 4.成功构建了 γ-GCS-pEGFP-c1 真核表达载体，测序结果与 γ-GCSmRNA 基因序 列序列一致。成功培养原代肾小管上皮细胞。早期细胞多呈梭形或圆梭形，苏木素 染色可观察到细胞核淡蓝染色，为体积较大的多边鹅卵石样。 结论： 在 LN 肾组织，炎症刺激的 TGF-β1 的高表达引起 γ-GCS 的表达降低，从而使 GSH 合成减少，LN 患者肾组织氧化-抗氧化系统失衡，肾组织产生的大量 ROS 介导 了纤维化因子 TGF-β1 在肾组织的促纤维化作用，一定程度上加速了肾间质纤维化的 进程。该研究为今后狼疮性肾炎的治疗研究提供了新的指导思路，为狼疮性肾炎致 病机理的进一步研究奠定了基础。成功构建了 γ-GCS-pEGFP-c1 真核表达载体和成功 培养原代肾小管上皮细胞，为进一步研究 γ-GCS 在肾间质纤维化的肾小管上皮细胞 中的作用，做了前期准备。 Research on the role of γ-GCS in the interstitial fibrosis of lupus nephritis English abstract Postgraduate：Zhang Bei ping Supervisor：Professor Tao Yi ABTRACT Lupus nephritis is one of th