活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化体外研究.docVIP

活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化体外研究 　　[摘要] 目的 探讨活化Notch2信号对高糖条件下核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导破骨细胞分化的影响， 　　初步明确Notch2信号在高糖条件下破骨细胞分化中的作用。方法 体外培养小鼠破骨前体细胞，在高糖条件下采用RANKL刺激破骨前体细胞。实验分为葡萄糖和甘露醇等渗对照组，每组设5个浓度（0、5、10、20、40 mmol·L-1）， 　　通过实时定量聚合酶链反应检测Notch2基因的表达水平，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨细胞分化情况。构建含Notch2细胞内片段（ICN2）的病毒载体（pMX-ICN2），转染包装细胞，收获病毒上清液感染破骨前体细胞；将病毒载体分为ICN2-OE（ICN2过表达）和EMPTY（仅感染pMX载体）两组，通过蛋白质印迹法检测ICN2蛋白的表达水平；并在高糖条件下（20、40 mmol·L-1）用RANKL刺激ICN2-OE和EMPTY组，设甘露醇等渗对照组，用TRAP染色检 　　测破骨细胞分化情况。结果 RANKL诱导破骨细胞分化过程中，葡萄糖浓度为20、40 mmol·L-1时，破骨细胞数分别为110.3±6.8和72.0±8.0，Notch2相对表达量分别为1.65±0.23和1.10±0.11；20、40 mmol·L-1甘露醇组的破骨细胞数分别为152.7±7.0和157.0±12.5，Notch2相对表达量分别为2.82±0.28和2.42±0.27，组间差异有统计学意义（P0.05）。 　　活化Notch2信号后，葡萄糖浓度为20、40 mmol·L-1时，ICN2-OE组破骨细胞数分别为206.7±7.8和178.3±11.5，EMPTY组分别为102.3±8.7和76.0±10.1，组间差异有统计学意义（P0.05）。结论 活化Notch2信号可促进高糖条件下破骨 　　细胞的分化。 　　[关键词] Notch2信号； 高糖； 破骨细胞分化 　　[中图分类号] Q 25 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.007 　　研究[1-2]发现：破骨细胞不仅是唯一能进行骨吸收的细胞，而且是参与牙槽骨组织改建的主要功能细胞。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而成。在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中，不仅受到包括核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）激活的Notch2在内的多种信号传导通路的调控[3-4]，而且受到包括血糖浓度在内的多种微环境因素的调控[5]。目前，有关Notch2信号在高糖条件下对破骨细胞分化情况的影响还不清楚。因此，探讨高糖条件下活化Notch2信号对破骨细胞分化的影响，不仅可以明确Notch2信号在糖尿病状态下牙槽骨改建中的作用，并且可以为寻找糖尿病性牙周炎的治疗方法提供新思路。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料和试剂 　　293T细胞；α-MEM、DMEM、特级胎牛血清、聚凝胺（polybrene）（Sigma公司，美国），RANKL、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美国）；pMXs（Cell Biolabs公司，美国）；LipofectamineTM 2000、TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国），SYBR GREEN试剂盒（Takara公司，日本），Notch2细胞内片段（intracellu-lar fragment of Notch2，ICN2）抗体（Cell Signaling公司，美国），T-PER组织蛋白提取试剂和BCA蛋白分析试剂（Pierce公司，美国）；聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene difluoride，PVDF）膜（Millipore公司，德国）。 　　1.2 细胞培养 　　取4周龄SD雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离完整的股骨和胫骨，暴露髓腔后用α-MEM培养基（含10%胎牛血清）冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止，然后接种于10 cm大小的培养皿中，在标准条件（饱和湿度、5%CO2、37 ℃）下培养12 h后收集非贴 　　壁细胞，1 500 r·min-1（离心半径15 cm）、37 ℃离心 　　5 min，弃上清液，视为破骨前体细胞[3]，加入M-CSF 　　（20 ng·mL-1）和RANKL（30 ng·mL-1）诱导其向破骨细胞分化。293T细胞用DMEM培养液培养。 　　1.3 高浓度葡萄糖刺激 　　按照浓度依次增高的顺序，设置0、5