水稻黑条矮缩病毒RNA干扰载体构建及遗传转化.docVIP

水稻黑条矮缩病毒RNA干扰载体构建及遗传转化 　　摘要：针对水稻黑条矮缩病毒S6、S10两条RNA双链，参考相关文献，设计了2对引物，通过RT-PCR获得了2条干扰片段，将这些干扰片段分别构建到RNA干扰载体中，进一步将整个RNA干扰片段构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以生物安全性的bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中，经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化，为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗性品种的培育提供候选材料。 　　关键词：水稻黑条矮缩病；RNA干扰（RNAi）；Ubi启动子；bar基因 　　中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0019-06 　　水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亚洲近3/4的人口以食用稻米为主。目前我国水稻常年种植面积约占全国粮食种植面积的30%，其产量占我国粮食总产量的40%以上。因此，稻米产量的高低及品质的优劣直接关系到人们的生活及健康，已受到人们越来越多的重视。 　　水稻黑条矮缩病（ rice black-streaked dwarf disease， RBSDD） 是由水稻黑条矮缩病毒引起的、由灰飞虱传播的一种病毒病，主要分布于中国、朝鲜、韩国和日本等东亚国家和地区， 对水稻、大麦、小麦、玉米等禾谷类作物造成危害。在20世纪60年代，该病曾广泛发生在我国华东诸市， 之后有一段沉寂期；20世纪90年代后期， 该病在浙江省再次爆发流行， 且蔓延速度非常快，对包括浙江、上海、江苏、安徽、江西以及福建北部在内的长江流域中东部整个稻作区的水稻生产造成毁灭性危害，发病田块一般减产10%～40%，重病田甚至绝产，造成了巨大的经济损失[1]。目前，对于水稻黑条矮缩病的防治主要是农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆虫种群数量大，防治效果不佳且对环境的影响较大。种植抗病品种是减轻农作物病虫害最经济、有效和环保的途径，但目前还未筛选到优良的抗水稻黑条矮缩病的抗性品种，因此筛选和培育抗水稻黑条矮缩病的水稻新品种显的尤为重要。 　　水稻黑条矮缩病毒（ Rice black-streaked dwarf virus， RBSDV） 属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus），全基因组测序工作已经完成，总长29 141 bp，至少含有13个开放阅读框[2， 3]，由10条dsRNA组成，按分子量大小分别命名为S1～S10，这10条基因组片段均具有保守的末端寡核苷酸片段 （5′GUUUUU-and-GUC 3′），该末端序列的保守性被确定为植物呼肠孤病毒科分类的一个重要标准，是病毒RNA而非寄主RNA包装的信号[4， 5]。其中病毒RNA 依赖的RNA 聚合酶、外壳蛋白、沉默抑制子等重要基因的功能已经基本明确，本研究选取的RBSDV基因组中S6、S10基因编码的蛋白分别为RNA沉默抑制子[6]和病毒外层衣壳。这为进一步利用基因工程手段培育转基因水稻抗病新品种奠定了基础。 　　RNA干扰是指设计合成与病毒同源的dsRNA，导入植物体并形成发夹结构，在植物体内对病毒基因组进行特异性酶切降解，抑制病毒扩张，从而使植物具有抗病毒能力。由于该方法可有效抑制目的基因的表达，对目的基因的表达具有可控性，近年来被广泛应用于新品种的培育。本实验参照水稻黑条矮缩病毒基因组中S6、S10的部分片段构建了RNA干扰载体，进一步通过农杆菌介导对水稻愈伤组织进行遗传转化，获得了部分转基因阳性植株，为下一步抗水稻黑条矮缩病水稻材料的筛选及培育提供了候选材料。 　　1材料与方法 　　11植物材料 　　正常及感染黑条矮缩病的水稻材料，均于2010年取自山东省农业科学院水稻研究所济宁水稻试验田自发病水稻植株，经液氮速冻后置于干冰内保存，带回实验室后迅速置于-70℃下保存备用。 　　12菌株及载体 　　大肠杆菌DH5α感受态购自Trangen公司；农杆菌LBA4404由本实验室保存；克隆载体pMD18-T购自Takara公司；植物表达载体pCA1300-Ubi为山东农业大学温孚江教授馈赠。 　　实验中使用的所有限制性内切酶、RNase A、Taq DNA Polymerase、T4 DNA ligase以及RNA反转录试剂盒Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A）等均购自Takara公司（大连宝生物）；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒等购自天根生化科技有限公司（北京）；全氏金Trizol试剂（Code：ET101-01）购于济南雨同生物科技有限公司；氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等抗生素均购自美国Amerisco公司