ZEB2在肝癌血管生成拟态形成中的作用研究-基础医学专业论文.docx

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学博士学位论文 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 研究背景和目的 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种常见原发性恶性肿瘤,具 有高转移率和高复发率。尽管近年来肝癌的治疗手段有了明显进展,但治疗效果 仍不尽如人意，患者的生存质量、存活时间都没有显著改善。不同于传统的肿 瘤血供模式，血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种独特的肿瘤微循环 模式，并且往往关联着肿瘤的侵袭、转移以及不良预后。在 VM 形成的分子机 制中，有较多的观点支持上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）参与其中，但两者之间的调控机制仍不明确。本研究旨在通过分析 EMT 转录因子 ZEB2 在人肝癌中表达和预后价值，初步揭示 ZEB2 与 VM 的关系；通 过研究细胞因子 TGF-β1 对体外肝癌细胞的诱导作用，进一步证实 EMT 参与肝 癌 VM 形成；通过研究 ZEB2 对细胞功能的影响，探讨 ZEB2 调控的 EMT 在肝 癌血管生成拟态形成中的可能作用机制。 方法 1）通过特殊染色方法—CD31/PAS 双重染色方法标记肝癌组织中 VM 管道结构。 免疫组织化学染色检测人肝癌组织中 ZEB2 的表达并分析 ZEB2 与 VM 形成、 临床病理参数的关系以及预后价值。 2）选取不能形成管道样结构的肝癌 HepG2 细胞系，用细胞因子 TGF-β1 诱导培 养，观察诱导前后细胞形态和成管能力的变化。 3）Western blot 检测 TGF-β1 诱导培养后的肝癌细胞 EMT 转录因子 Twist1、Snail、 Slug 和 ZEB2 的表达情况；检测 EMT 相关分子 E-cadherin, Vimentin 及内皮 相关分子 VE-cadherin 的表达情况。 4）Western blot 检测四种肝癌细胞系 HepG2, Bel7402, PLC 和 SMMC7221 中 ZEB2 的表达情况。 5）筛选出低表达和高表达 ZEB2 的肝癌细胞系，分别上调和下调 ZEB2 的表达, 并观察 ZEB2 高、低表达对细胞成管能力及内皮相关分子表达的影响。 6）Western blot 和免疫荧光染色检测 ZEB2 高、低表达对肝癌细胞 EMT 相关分 子 E-cadherin、Vimentin 表达的影响。 7）细胞划痕和侵袭实验检测 ZEB2 高、低表达对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影 I 响。 8）明胶酶谱检测 ZEB2 高、低表达对肝癌细胞 MMP-2 和 MMP-9 活性的影响。 结果 1）92 例人肝癌组织样本中发现 17 例存在 VM，其发生率为 18%。免疫组化染 色发现 ZEB2 细胞浆表达 53 例（57.6%），ZEB2 核表达 21 例（22.8%）。ZEB2 核表达 VM 形成、临床分期和肝癌患者的复发/转移有关(P0.05)。生存分析 提示具有 ZEB2 细胞核表达或者 VM 阳性的肝癌患者总生存期均较短。多因 素分析结果表明 ZEB2 是肝癌患者总生存期的独立预后因素(P0.05)。 2）TGF-β1 诱导培养肝癌 HepG2 细胞，细胞由典型的上皮样表型转变为间充质 样表型并获得了形成管道样结构的能力，能在体外形成 VM 样结构。 3）TGF-β1 诱导培养后的 HepG2 细胞 EMT 转录因子 ZEB2 的表达显著增强，而 对 Twist1、Snail 和 Slug 的影响不明显；间叶标记分子 Vimentin 表达增高， 而上皮标记分子 E-cadherin 表达下降；内皮相关分子 VE-cadherin 表达增高。 4）Western blot 检测证实在四种肝癌细胞系 HepG2, Bel7402,