“粉玉”体色瓯江彩鲤MHCⅡ类基因多态性与鱼体抗病力的关系及补体C9基因的全长克隆与表达水生生物学专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 II II 基替换率(dS)的比值 ω 分别为 1.366、0.992、0.792，表明“粉玉”体色瓯江彩鲤 MHC class IIβ 基因的 β1 结 构 域 在 进 化 过 程 中 受 到 正 向 选 择 作 用 。 基 因 Cyca-DAB3*09 在抗病群体中出现的频率(7.81%)显著高于感病群体(1.37%， P0.05)，新等位基因 Cyca-DAB3*18(频率为 3.13%)只出现在抗病群体中，基因 Cyca-DAB1*08、Cyca-DAB3*08 和 Cyca-DAB3*17 为感病群体所特有。 2、MHC class IIα 基因的多态性及其与鱼体抗病力的关系 对 43 尾“粉玉”体色瓯江彩鲤的 207 个有效克隆进行测序，获得 105 条不 同的 MHC class IIα 编码序列，分属 11 个不同的等位基因，Cyca-DXA13、 Cyca-DXA14、Cyca-DXA15 和 Cyca-DXA16 为新发现的 4 个等位基因。核苷酸、 氨基酸变异位点总数为 214、109，变异率较高( 34.29%、52.40%)。MHC class IIα 基因片段的长度为 624bp，包括第 1?4 个外显子，分别编码 33bp 的信号肽、252bp 的 α1 和 285bp 的 α2 结构域及 54bp 的连接肽/跨膜区。α1 结构域的变异明显大于 α2 结构域，表现在 α1 结构域中核苷酸和氨基酸变异位点比例(40.87%和 61.9%) 远高于 α2 结构域的变异位点比例(31.58%和 51.58%)。在 α1 结构域的 21 个抗原 结合位点(PBR)上，有 17 个发生了变异。α1 结构域的 PBR 区的非同义碱基替 换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值 ω 为 5.186，远远高于非抗原结合位点 (non-PBR)及 β2 结构域的 0.796、0.531，表明“粉玉”体色瓯江彩鲤 MHC class IIα 基因的 α1 结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因 Cyca-DXA5 和 Cyca-DXA10 在抗病群体中出现的频率极显著高于其在感病群体中出现的频率 (P0.01)；新等位基因 Cyca-DXA15 为抗病群体所特有，且出现的频率(4.62%) 达到了极显著水平(P0.01)；而等位基因 Cyca-DXA8 在感病群体中出现的频率 (19.72%)极显著高于其在抗病群体中出现的频率(1.54%, P0.01)。组织表达分析 结果表明，MHC IIα 基因在健康鱼的肝脏中表达量最高，其次是脾和肌肉，肠中 的表达量最低。感染嗜水气单胞菌后，MHC IIα 基因在肝和脾中的表达量均急剧 下降，在感染后 72h 和 96h 又呈现上升的趋势。而肾在感染 12h 内表现出应急反 应，表达量上升，随着时间的推移，表达量又降低。 III III 3、补体 C9 基因的全长克隆与表达分析 补体 C9 是构成膜攻击复合体直接导致靶细胞溶溃的重要组成成分。我们采 用 RACE 技术，首次成功克隆出“粉玉”体色瓯江彩鲤补体 C9 基因的 cDNA 全 长。该序列全长 2158bp，包括 24bp 的 5′-UTR、2022bp 的开放阅读框(Open reading frame, ORF)和 112bp 的 3′-UTR，编码一个由 674 个氨基酸组成、分子量为 73.16kDa 的前体蛋白，第 1-19 个氨基酸为信号肽，在 3′-UTR PolyA 尾上游 57bp 处出现一个多聚腺苷酸加尾信号 AATAAA。序列分析表明，“粉玉”体色瓯江彩 鲤 C9 基因具有 TSP、LDL-R、MACPF 和 EGF 样等 4 个保守结构域。C9 的蛋白 序列含有 28 个保守的半胱氨酸残基，第 256 位存在一个长度为 74 个氨基酸的富 含甘氨酸(Glycine, Gly)的区域。系统进化分析表明，“粉玉”体色瓯江彩鲤 C9 的氨基酸序列，与草鱼(Ctenopharyngodon idella)的相似性最高（77.5%），与其他 鱼类的相似性在 41.8%~44%之间，而与哺乳动物的相似性（33.5%~36.7%）则较 低。半定量结果显示，C9 基因在健康“粉玉”体色瓯江彩鲤的肝、脾和肾中有 表达，其中肝脏中的表达量最高，其次是脾。实时荧光定量 PCR 检测的结果显 示，感染嗜水气单胞菌后，12h 内肝脏中的表达量激增，24h 时又骤减，随后又 增高，72h 时表达量升高至正常水平的 20.80 倍，96h 时又降到 3.03 倍。在脾和 肾中，感染 24h 内表达量持续上升，24h 时达到最高，随后又急剧降低，到 96h 时基本降为正常水平的 0.5