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猪TCAP基因转录因子的筛选与鉴定 　　摘要：克隆了猪TCAP基因1 662 bp的启动子序列，序列分析发现其启动子区域存在MyoD、MyoG、MEF2转录因子结合位点，并构建了3个转录因子超表达载体，分别与TCAP基因启动子载体共转染PK细胞。结果表明，3个转录因子使TCAP基因启动子活性升高，均正调控TCAP基因的表达。 　　关键词：猪；TCAP基因；转录因子；表达调控 　　中图分类号：S828；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6299-04 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.24.052 　　Abstract：In this study，1 662 bp sequence of pig TCAP gene promoter was cloned. Some specific transcription factor （MyoD， MyoG and MEF2） binding sites were found in TCAP gene promoter by bioinformatics analysis. Over-expression vectors of MyoD，MyoG and MEF2 were successfully constructed and transfected with promoter sequences， respectively. Detection analysis showed that TCAP promoter activity was significantly higher. The results indicated that transcription factors MyoD，MyoG and MEF2 could bind to the TCAP promoter sequences， and enhance its activity. 　　Key words：pig；TCAP gene； transcription factor； expression regulation 　　TCAP蛋白是一种在横纹肌和心肌中特异性表达的蛋白，是肌联蛋白激酶的作用底物[1]，其能调节肌原纤维的组装和肌原纤维的翻转[2]。研究表明，该基因与肌肉萎缩、心肌症、肌肉营养不良、心肌损伤等相关[3-5]。 　　基因表达调控研究是当前分子生物学研究的热点之一，而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步，转录因子是能与基因特定序列专一性结合，从而调节目的基因表达的蛋白质分子[6]。转录因子在转录调控过程中直接或间接地识别和结合在顺式作用元件的核心序列上，参与调控靶基因的转录。因此筛选与鉴定基因的转录因子成为研究基因表达调控最为重要的一步，并为研究基因表达调控奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　PK细胞由动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室保存（采用含10%热灭活小牛血清的DMEM培养基，于5% CO2孵育箱内37 ℃常规培养）。pGL3-basic载体购自Promega公司；限制性内切酶、连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；DMEM培养基、LipofectionAMINE2000转染试剂盒购自Invitrogen公司。 　　1.2 质粒构建 　　根据猪染色体序列设计引物TpF/TpR（表1），以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增体系中各组分为50 ng模板DNA、1×PCR Mix、0.5 mmol/L PCR primers。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃继续延伸10 min。以TproF/TproR为引物，以TCAP基因启动子扩增产物为模板，PCR扩增产物用限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ（Fermentas， Japan）消化后，连接到pGL3-Basic载体。 　　根据MyoD （NCBI，No. GU249575.1）、MyoG（NCBI，No. AY921006.1）、MEF2（NCBI， No. DQ343149.1）基因的序列，分别设计引物MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R（表1），反应程序同上，引物MyoD/MyoG PCR扩增产物经Kpn Ⅰ-EcoRⅠ酶切，引物MEF2 PCR扩增产物经Nhe Ⅰ-XhoⅠ酶切后，分别连接到pcDNA3.1载体。 　　1.3 细胞转染 　　PK细胞经胰蛋白酶消化后，接种于24孔板中，培养达到50%～60%融合后，在清洁的EP管中用无血清培养基OPTI-DMEM稀释1 μL 质