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山葡萄DFR基因全长cDNA克隆与序列分析 　　摘要：应用RT-PCR和 SMART RACE等技术克隆山葡萄二氢黄酮醇4-还原酶基因的全长cDNA序列，结果表明，该基因全长1 362 bp，包括1 014 bp的完整开放阅读框，推测其编码337个氨基酸。该基因表达产物相对分子质量为37.50 ku，等电点为5.95，是稳定蛋白，不包含信号肽。蛋白质疏水性分析结果表明，DFR疏水性最大值为2.511，最小值为-2.267，平均值为-0.146，整体表现为亲水性。二级结构分析结果表明，DFR的二级结构主要以α-螺旋（35.31%）和不规则卷曲（46.29%）为蛋白最大量的结构元件。对不同植物DFR氨基酸序列进行多重比对发现，同源性较高，DFR与NADPH结合区域和底物结合区域都表现出高度保守。用推导的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同源性比较，其氨基酸序列与欧亚种葡萄、大豆、矮牵牛等植物的DFR氨基酸序列两两比对的相似性系数分别为98%、76%、74%。 　　关键词：山葡萄；二氢黄酮醇4-还原酶；克隆；序列分析 　　中图分类号： S663.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0034-05 　　山葡萄（Vitis amurensis）为葡萄科葡萄属多年生藤本植物，植株似葡萄而细小。山葡萄是葡萄属中最抗寒的一个种，是葡萄属植物抗性育种的珍贵资源，已被多个国家和地区所重视。山葡萄是一种经济价值很高的野生经济植物，成熟后的果实味甜酸，富含果汁，可生食，用山葡萄浆果酿造的葡萄酒品质优良，是我国东北地区葡萄酒工业的主要原料。葡萄酒具有预防心脑血管疾病的作用，原花青素[1]是其中最主要的作用成分。研究表明，原花青素存在较强的抗氧化活性和抗癌活性，对降低毛细血管的渗透性有重要的药理作用。葡萄酒的品质与葡萄中原花青素的含量有直接关系[2]。花青素类化合物也是植物中可溶性天然色素的主要来源，因此研究花色苷植物资源有重要意义。花青素直接或间接影响果实的外观颜色形成，在合成花青素过程中[3]，DFR（dihydrofla-vonol 4-reductase，二氢黄酮醇-4-还原酶） 起决定性作用。DFR反应需要NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）的参与。DFR依赖DHM（dihydromyricetin，二氢杨梅黄酮）、DHK（dihydrokaempferol，二氢堪非醇）、DHQ（dihydroquercetin，二氢栎皮黄酮）3种底物，它们结构相似，只在B苯环上的羟基数目上不同，DFR将DHM、DHK、DHQ底物还原，分别生成相应的无色花翠素、无色花葵素、无色花青素[4]，通过后续途径最终将无色的二氢黄酮醇转化合成有色花色素[5]。不同物种DFR对3种底物具有选择特异性[6]，所以能合成不同的花色素[7]，导致植物呈现出不同的花色、果色。DFR基因最早由OReilly等于1985年从金鱼草（Antirrhinum majus）和玉米（Zea mays）中分离得到[8]。目前，研究人员已经从许多不同的植物中成功分离出DFR及其他基因[9]，但对山葡萄中的DFR研究尚未见报道。本研究以山葡萄为试验材料，利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）等方法[10]克隆DFR全长基因，成功得到山葡萄DFR基因的cDNA全长序列，并进行生物信息学分析以及序列比对，旨在为分析及调控山葡萄中花色苷的合成提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 试材山葡萄双丰（V.amurensis ‘Shuang Feng’）采自国家山葡萄种质资源圃，采摘无病虫害、饱满的成熟期果粒，立即置于液氮中冷冻，-80 ℃冰箱中保存，取其果皮作为供试材料。 　　1.1.2 试剂材料 Tris-HCl、CTAB、EDTA、LiCl、β-巯基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal为AITiresco分装试剂；大肠杆菌（Escherichia coli） DH5-α、pMD19-T载体、Taq酶、Marker DL2000购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购于Omega公司；反转录酶SuperScript Ⅱ购自Invitrogen公司；SMARTTM RACE试剂盒购于Clonteeh公司；其他试剂为国产分析纯。引物由英俊生物技术有限公司合成，DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 登录NCBI网站，根据GenBank中已登陆的DFR基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通过多序列比对确定其共有的保守区，利用Primer 6.0设计1对特异引物（用来扩增目的片段）：VAmDFRs，5′-TCATCGGTT