应用高效液相色谱―二极管阵列检测器び呕棉花体内多胺测定方法.docVIP

应用高效液相色谱―二极管阵列检测器び呕棉花体内多胺测定方法 　　摘要：应用高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）对棉花体内多胺测定时的流动相比例及流速、多胺全光谱信息等进行分析，重点比较2种常用检测波长230、254 nm下的测定参数。最终确定检测波长为230 nm、流动相体积比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速为0.6 mL/min为最佳色谱条件。该方法有较好的准确度、灵敏度，腐胺、亚精胺、精胺的回收率分别为98.58%、96.98%、99.62%，且非常稳定。以此色谱条件为基础测定棉花幼苗不同组织中多胺水平发现，叶片中3种多胺的含量明显高于根、茎组织；此外，不同组织内亚精胺含量最高。 　　关键词：棉花；幼苗组织；多胺含量；高效液相色谱；二极管阵列检测器 　　中图分类号： S562.01文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2016）08-0328-04 　　多胺（polyamines，PAs）是一类含有多个氨基的长链脂肪族化合物，广泛存在于生物体内。在植物代谢途径中，目前比较清楚的多胺形式主要有腐胺（putrescine，Put）、亚精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）[1-2]。研究表明，多胺在植物体内是一类重要的生长调节因子，参与植物的细胞分裂[3-4]、性别分化[5]、果实成熟与衰老[6]、逆境适应[7-10]等重要生理过程。在分子水平的研究中还发现，多胺参与DNA的复制、转录、膜稳定、RNA和蛋白质的翻译[11]、DNA凝聚及激素的调控[12]等过程。另外，在人体中也存在大量多胺类物质，并与人类健康息息相关[13]。由于植物性食物是人体内多胺的重要来源之一[14]，因此，如何准确而快速地检测植物组织中的多胺技术越来越受到人们的重视。 　　多胺的测定以前主要用氨基酸分析仪、纸电泳等方法[15-16]，这2种检测方法样品回收率低，检测灵敏度也不高。目前多用衍生化的方法，即将多胺的一、二级氨基接在卤素原子上，另外还有接在荧光基团或对紫外有吸收的基团上，再通过气相（GC）或液相（HPLC）方法进行分离检测。其中，气相色谱刚刚应用在植物多胺的研究方向，虽然分析时间短，但是对试样要求高，前处理过程比较复杂[17]，并且应用质谱检测设备价格昂贵，且分离检测效果没有显著提高。自从1979年Redmond等采用苯甲酰化的方法以来，随着不断改进，高效液相色谱法已经成为较为成熟的检测植物体内多胺的方法[18-21]。目前主要应用荧光检测器（FLD）、紫外吸收检测器（UV）。其中，FLD法检测多胺的主要优势在于灵敏度高[22]，但要用到有毒流动相乙腈。另外，由于瑞利散射、拉曼散射的干扰，使荧光检测方法的条件构建和优化过程较为复杂，没有一定的专业基础较难完成。而紫外吸收法虽然灵敏度并不突出，但是可以用于植物体内多胺含量的测定，加上流动相中的甲醇毒性较低、仪器成本较低等优点，使得紫外吸收法成为当今国内用于测定植物多胺最常用的一种方法。 　　目前对于紫外吸收法检测波长的选择主要是苯甲酰氨基特征峰230 nm处、苯基特征峰254 nm处[15-16，18，23]。以上2种选择对于多胺的检测虽然都有一定的根据，但是对于检测效果尚缺乏科学的比较。本研究应用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）广谱记录光谱信息，同时针对棉花幼苗组织样本特点比较230、254 nm 2种检测波长的操作性、可靠性，最终优化建立了可应用于UV检测器的棉花幼苗组织样本中3种多胺的检测方法，并依据该方法比较棉花幼苗根、茎、叶组织内多胺含量的差异。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　供试棉花种子由廊坊师范学院生命科学学院遗传与育种研究所提供，为农大棉7号。 　　1.2试验方法 　　1.2.1棉花幼苗组织中多胺的提取取1.0～2.0 g棉花3叶期幼苗的不同新鲜组织，液氮研磨后加入4 mL预冷的5%高氯酸溶液，冰浴浸提1 h后离心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）；取上清液为样液，4 ℃保存备用。 　　1.2.2样品的苯甲酰化取500 μL样液，加入10 mL离心管中，先后加入14 μL苯甲酰氯、1 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液，振荡混匀后于37 ℃水浴反应20 min；加入2 mL饱和氯化钠溶液，混匀后用2 mL乙醚萃取，离心（1 500 r/min，5 ℃，5 min）后取1 mL乙醚相真空干燥，用100 μL甲醇溶解后，用0.22 μm孔径有机相滤膜过滤，即可进样[21]。 　　1.2.3色谱条件的优化色谱仪：Agilent 1260 Infinity；色谱柱：[JP3]Agilent ZORBAX SB-C18 Stable